| 研究課題/領域番号 |
15590259
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| 研究機関 | 川崎医科大学 |
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研究代表者 |
高田 穣 川崎医科大学, 医学部, 教授 (30281728)
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| 研究分担者 |
石合 正道 川崎医科大学, 医学部, 助教授 (90298844)
松下 暢子 川崎医科大学, 医学部, 助手 (30333222)
平野 世紀 川崎医科大学, 医学部, 助手 (20368616)
北尾 洋之 川崎医科大学, 医学部, 助手 (30368617)
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| キーワード | DNA二重鎖切断 / DNA修復 / I-SceI / TAT配列 / エストロジェン受容体 |
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| 研究概要 |
本研究では、高等動物培養細胞株を用いて、単一の染色体部位にDNA二重鎖切断(DSB)を誘導し、その後の修復過程をリアルタイムモニタリングするシステムを構築する事を試みた。原理的には以下のような方法論である。特異的配列を認識してDNAを切断する制限酵素を、認識配列を含んだ人工基質をあらかじめ染色体に1コピー組み込んだ細胞に導入する。導入法として、18塩基認識制限酵素I-SceI細胞内移行シグナルの11アミノ酸(TAT配列)を付加した組み換え蛋白を作製する。培養液に添加することで細胞内導入が高効率に期待できる。また、エストロジェン受容体との癒合蛋白として発現させ、タモキシフェン添加によって一気に核内に移行させる。発光蛋白でマーキングした修復分子と切断部位をリアルタイムイメージングしたり、DNA末端形状をゲノムサザンブロットでモニターしたり、クロマチン免疫沈降によって修復蛋白のリクルートメントを検討出来る可能性がある。
I-SceI制限酵素とTAT配列との融合蛋白(TAT-I-SceI)、さらにGSTとの融合蛋白(GST-TAT-I-SceI)を大腸菌で発現させ精製した。現在、精製条件の最適化を行っている。
また、I-SceIとERとの融合蛋白(ER-I-SceI-ER、ふたつのエストロジェン結合ドメインでI-SceIをはさんでいる)を作製したところ、核内への移動は迅速であったが、本来のI-SceIにくらべ二桁ほどDSB導入効率が低下していた。I-SceIのN末へのGFPの融合は機能を阻害しないことがわかっているので(未発表データ)、ER-CFP-I-SceI融合蛋白を作製し細胞に発現させた。現在その細胞でうまくI-SceIが制御可能かどうかの検討中である。
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