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1:野生型(448アミノ酸)とアミノ末端欠失型(318アミノ酸)NS5A遺伝子(H株由来)をサイトメガロウイルスプロモーター制御下にタンパク発現可能な哺乳類発現プラスミドベクターにサブクローニングし、リポゾームを用いたヒト肝細胞癌由来培養細胞(HepG2細胞)への一過性トランスフェクションにて野生型ならびにアミノ末端欠失型NS5Aタンパクの発現をウエスタンブロット法にて確認した。野生型とアミノ末端欠失型NS5Aのカルボキシル末端にはFLAGタンパクを添加したため、タンパクの発現は抗FLAG抗体を用いたウエスタンブロット法にて確認可能であった。
2:一方、カバーグラス上で培養したHepG2細胞に同様の方法で、上記のプラスミドベクターをトランスフェクションし、一次抗体として抗FLAG抗体を用いて、蛍光抗体法でNS5Aタンパク発現を検討した。タンパク発現は蛍光顕微鏡下に観察可能であった。興味あることに、野生型NS5Aタンパクが細胞質内に発現するのに対して、アミノ末端欠失型NS5Aタンパクは核に蛍光シグナルがみられた。以上より、NS5Aタンパクのアミノ末端を欠失させることにより、このタンパクが核に移行することが示唆された。
3:上記1で行ったHepG2細胞への一過性トランスフェクション法に引き続いて、ネオマイシン(G418)500μg/mlで選択をかけ、クローニングリングを用いて、HepG2単細胞株を拾い上げた。個々の細胞株を培養し、NS5Aタンパクの発現をウエスタンブロット法にスクリーニングしたところ、野生型とアミノ末端欠失型NS5Aタンパクを発現する安定HepG2細胞株が得られた。また、テトラサイクリン-オフ系によるNS5A発現細胞株の樹立を現在行っている。
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