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本年度はin vivoエレクトロポレーション(EP)法を用いて筋肉内にTSH受容体(TSHR)を発現を誘導させることにより、バセドウ病モデルマウスを作製した。さらに、doxycycline投与により発現誘導が可能なTSHRトランスジェニックマウスの作製を試みた。
1)TSH受容体(TSHR)発現ベクターの作製
発現ベクターとしてpBacMam2を用い、TSHR-全領域(TSHR-WT)および細胞外領域(TSHR-289His)を組み込んだ。
2)バセドウ病モデルマウスの作製
エレクトロポレーターを用いた。電極間の大腿部筋肉に各ベクター(50μg/site)を注入し、50V、負荷時間50msecの条件で6回のパルスを与えた。
3)甲状腺刺激抗体(TSAb)活性の検出
TSAb活性は、教室において樹立したヒトおよびマウスTSHR発現株(CHO-K1-TSHR)を用い、細胞内cAMP上昇活性をcAMPキットを用いて測定した。
4)モデル動物の作製
pBacMam2-TSHR-WTは、2回目のEP後1/25匹発症し、TSHR-289Hisでは、14/25匹であった。また、pBacMam2-TSHR-289Hisの2回EP後のTSAb活性は、最大でcontrolの平均値の15倍の値を示した。
5)変異TSH受容体発現細胞の作製
エレクトロポレーション法により変異TSH受容体遺伝子(欠失および点変異)を導入し、糖鎖変異TSH受容体発現による発症率の差異を検討した。
6)TSH受容体発現トランスジェニックマウスの作製
pBS/CMV/lox-lacZにTSH受容体遺伝子(+rtTA)、K14-NLCにCreDNAを各々挿入し、交配後、doxycyclineにより発現誘導が可能なTSHRトランスジェニックマウスを作製した。
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