| 研究概要 |
目的
Cytochrome b(cyt b)遺伝子は動物や植物などの系統樹作製の解析ツールとして汎用されている。リーシュマニア原虫によって起こるリーシュマニア症の病型は皮膚型、粘膜皮膚型、内臓型に大別されている。本症ではそれら原因原虫種と病型や予後が相関することが特徴のひとつである。従来原虫種の同定はアイソエンザイムやモノクローナル抗体などで行われていたが、我々はリーシュマニア原虫の全cyt b遺伝子の塩基配列を決定し、同遺伝子の系統樹からリーシュマニア原虫種の同定、分類を行い、さらに臨床的に応用することを目的に本研究を行った。
方法
1)最初に解析したWHO標準株13種(14株)原虫種のcyt b遺伝子の塩基配列の結果(原虫の種の違いによる塩基配列の多型は245カ所に認められ、190カ所が原虫の同定に使用可能)をもとに、各原虫種で変異の多い部位にprimerを設定して、簡便に原虫種を同定することを試みた。
2)前回解析した原虫種はWHO標準株13種(14株)に加え、計26株(Endotrypanum3種を含む)のcyt b遺伝子を解析した。
3)リーシュマニア原虫からDNAを抽出し、cyt b遺伝子の上流遺伝子(L.cyt-S)と下流遺低子(L.cyt-R)上にPCR primerを設定し,866bpのcyt b遺伝子の一部を増幅した。増幅されたDNA断片をdirect sequencing法でDNA断片の塩基配列を決定した。
4)決定したcyt b遺伝子の塩基配列を用いて、近隣結合法(NJ法)および最節約法(UPGMA法)により分子系統樹を作成した。
結果
1)cyt b遺伝子(866bp)の分子系統樹の結果は、Leishmania Leishmania tropica (L.(L.)tropica)complexにはL.tropica, L.Kilicki, L.aethiopica, L.major, L.major-likeが、L.donovani complexにはL.donovani, L.archibaldi, L.chagasi, L.infantuが、L.mexicana complexにはL.amazonensis, L.garnhami、L.mexicana, L.pifanoiが、L.braziliensis complexにはL.braziriensis (INH-03,M2904,M2903,LTB300)、L.guyanensis, L.panamensis, L.shawiの4つのカテゴリーに分類でき、それらのカテゴリーと離れた位置にEndotrypanummonterogeii, E.schaudenii, L.deaneiに分類できた。なお従来Leishmania原虫とされていたL.deaneiは非病原性原虫のEndotrypanumと思われる。
結論
リーシュマニア原虫26種(Endotrypanum3種を含む)のcyt b遺伝子の塩基配列を決定し、塩基配列により原虫種の同定が可能であることを示した。この結果は、将来的には培養原虫や皮膚病変からの原虫の検出・同定に応用可能と考えられる。
臨床応用
我々はcyt b遺伝子の一部にconsensus primerを作成し、パキスタン在住患者の生検皮膚病変に対しPCRを行い、臨床応用を試みつつある。パキスタン在住患者に応用したところ21例の患者の解析を終了し、その塩基配列の結果は16例がL.L.major、5例がL.L.troplcaのcyt b遺伝子と一致した。
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