| 研究概要 |
本研究は我々が発見したγ-glutamyl transpeptidase活性を示すヒト精液特異ユビキチン化CD10-CD13酵素複合体(SEGAP)が細胞外のプロテアソーム非存在下でどのような生理活性を示すのかを解明することを目的とする。その中でSEGAPがヒト由来培養細胞の誘導型一酸化窒素合成酵素(iNOS)の発現を促すことが観察された。iNOSは炎症性に誘導され、産生されたNOは多彩な病態生理活性を発揮する。iNOSを直接検出するにはウェスタンブロット法が用いられてきたが手技が複雑であるため一般化されていない。そこで、iNOSの特異的配列に従って合成したペプチドおよびマウスiNOSに対する抗体を作製し、サンドイッチELISAによる定量的検出を試みた。
【方法】ラットiNOSに特異的でN-末端に近いアミノ酸配列にシステインを加えた17個のペプチドを合成した。牛血清アルブミン(BSA)とカップリングさせたペプチドをウサギに免疫した。ペプチドを結合させたアフィニティークロマトグラフィーにより精製したペプチド抗体の一部をビオチン化し二次抗体とした。一方、リコンビナントマウスiNOSを抗原として同様にウサギに免疫し、プロテインAカラムにより精製した抗マウスiNOSのIgG分画を一次抗体とした。
【結果】リコンビナントマウスiNOSを標準としたサンドイッチELISAでは、10-100ng/mlで直線性が観察され、約3ng/mlまで検出可能であった(>0.1=O.D.)。また、BSA、組織ホモジネート(10,000xg上清)およびヒト血清に標準iNOSを添加した結果、BSAはiNOS検出に大きな影響は与えなかったが、ホモジネート中のiNOSの検出感度はやや低い傾向にあり、ヒト血清中では大幅に低下した。そこで、ホモジネートにiNOSを添加後に100,00xgで1時間遠心した上清を測定した結果、ブランクの吸光度が低下し、良好な検量結果が得られた。従って、臓器中のiNOS検出への応用も可能と考えられた。
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