| 研究概要 |
本研究は我々が発見したヒト精液特異ユビキチン化CD10-CD13酵素複合体(SEGAP)がプロテアソーム非存在下でどのような生理活性を示すのかを解明することを目的とする。その中でSEGAPがヒト由来培養細胞(HL-60)の誘導型一酸化窒素合成酵素(iNOS)の発現を促すことが観察された。iNOS発現誘導による過剰なNO生成は病態生理活性を示す。iNOSを直接検出するにはウェスタンブロット法が用いられてきたが手技が複雑であるため一般化されていない。そこで、iNOSの特異的配列に従って合成したペプチドおよびマウスiNOSに対する抗体を作製し、サンドイッチELISAによる定量的検出法を開発した。今回、このELISAによりラット組織中のiNOSタンパク質の定量を試みた。
【方法】アフィニティークロマトグラフィーにより精製したペプチド抗体の一部をビオチン化し二次抗体とした。リコンビナントマウスiNOSを抗原とし、プロティンAカラムにより精製した抗マウスiNOSのIgG分画を一次抗体とした。リコンビナントマウスiNOSを標準としてELISAを行なった。
【結果】ラットの肝ホモジネートに標準iNOSを添加後に100,000xgで1時間遠心した上清を測定した結果、良好な回収率と0.1から2ngの範囲で直線性を示す検量線が得られた。Lipopolysaccharide(LPS)によりiNOSは強く誘導されることから、LPSを投与したラットの肝におけるiNOSの発現をRT-PCRによるmRNAの半定量とELISAにより観察した。その結果、iNOSmRNAが発現していないコントロール肝ではmgタンパク質あたり0.6ng以下で、mRNA発現が観察されたLPS投与ラット肝では約1.4ngのiNOSタンパク質が定量された。以上から、ELISAにより細胞・組織中のiNOS測定が可能と考えられた。
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