膵癌の悪性度を規定する新規分子標的の探索

2003 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 15590621
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 小松 裕 東京大学, 医学部附属病院, 助手 (90301100)
• 研究分担者: 大塚 基之 東京大学, 医学部附属病院, 医員 ; 立石 敬介 東京大学, 医学部附属病院, 医員 ; 川上 高幸 東京大学, 医学部附属病院, 医員 ; 伊地知 秀明 東京大学, 医学部附属病院, 医員
• キーワード: 膵癌 / シグナル伝達 / トランスクリプトーム解析 / プロテオーム解析

研究概要

1、RNAi vectorによるSmad4 knockdown膵癌細胞株の樹立
Smad4遺伝子中にknockdownのtarget配列を5箇所選択し、その配列を含むshort hairpin RNAを発現するplasmid vectorを作成した。まず一過性の発現にて最も強力にSmad4蛋白の発現を抑制するvectorを選び出した。このRNAi vectorと空vectorを用い、TGF-・-Smadシグナル伝達系の保たれている膵癌細胞株(PANC-1)に遺伝子導入しstable transfectantを選択した。得られた細胞株では、空vectorの導入された細胞株(PANC-1-puro)ではSmad4蛋白は正常に発現していたが、RNAi vectorの導入された株(PANC-1-S4KD)ではWestern blot上Smad4蛋白はほぼ完全に消失していた。またTGF-・-Smadシグナルをluciferaseによるreporter assayにて検討したところ、Smad4が機能的にもknockdownされていることが証明された。
2、Smad4 knockdown細胞株におけるTGF-・シグナルの標的分子の網羅的探索
PANC-1-puro及び-S4KDの細胞プール(複数クローンの混合)をそれぞれTGF-・で刺激し、刺激の有無により発現の変化する分子をトランスクリプトーム及びプロテオーム解析にて網羅的に検索した。まずそれぞれのRNAを3756遺伝子の搭載されたcDNA microarrayで検討したところ、-puro株では155遺伝子、-S4KD株では187遺伝子が刺激による有意な発現変化を示した。これらの標的分子のうち幾つかについては定量的RT-PCRを行い、その発現変化を確認した。またそれぞれの細胞の蛋白を二次元電気泳動で展開し、発現の変化した12種の蛋白をMALDI-TOF/MSもしくはMALDI-TOF/TOFにて同定した。

研究成果

• [文献書誌] Ijichi H, et al.: "Smad4-independent regulation of p21/WAFl by transforming growth factor-beta."Oncogene. 23(5). 1043-1051 (2004)
• [文献書誌] Otsuka M, et al.: "Comparing gene expression profiles in human liver, gastric, and pancreatic tissues using full-length-enriched cDNA libraries."Hepatol Res.. 27(1). 76-82 (2003)
• [文献書誌] Otsuka M, et al.: "Liver chip and gene shaving."J Gastroenterol. 38. 89-92 (2003)
• [文献書誌] Taniguchi H, et al.: "Hepatitis C virus core protein upregulates transforming growth factor-beta 1 transcription"J Med Virol. 72(1). 52-59 (2004)
• [文献書誌] Otsuka M, et al.: "Differential cellular gene expression induced by hepatitis B and C viruses."Biochem Biophys Res Commun. 300(2). 443-447 (2003)
• [文献書誌] Otsuka M, et al.: "Vitamin K2 inhibits the growth and invasiveness of hepatocellular carcinoma cells via Protein Kinase A activation."Hepatology. (In press).