| 研究課題/領域番号 |
15590621
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
小松 裕 東京大学, 医学部附属病院, 助手 (90301100)
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| 研究分担者 |
立石 敬介 東京大学, 医学部附属病院, 助手
川上 高幸 東京大学, 医学部附属病院, 医員 (60376457)
大塚 基之 東京大学, 医学部附属病院, 医員
伊地知 秀明 東京大学, 医学部v属病院, 医員
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| キーワード | proteomics / microarray / Smad4 |
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| 研究概要 |
膵癌細胞株を用いてSmad4のKnock downもしくはrescueを行いTGF-βシグナルの標的分子の発現変化を網羅的に解析した。方法は、(1)Smad4遺伝子の完全欠失株BxPC-3にSmad4を発現させ、TGF-β刺激にて発現の変化する分子をmicroarrayを用いて抽出した。(2)Smad4正常株PANC-1のSmad4をRNAiにて恒常的にKnock downし、TGF-β刺激にて発現の変化する分子をmicroarrayおよび蛋白二次元電気泳動・質量分析によるプロテオーム解析にて検出した。得られた標的分子について定量的RT-PCR、Western blot.遺伝子のプロモーター領域の転写活性化等の検討を行った。
(1)BxPC-3のarrayからは、TGF-β-Smadシグナルの代表的標的分子p21/WAF1がTGF-βによるSmad4非依存的な発現増強を示し、その機序はSmad2/3依存的な転写活性化であることが判明した。更にBxPC-3はSmad4非依存的にTGF-βによる増殖抑制を示した(Oncogene.2004 Feb 5;23(5):1043-51)。
(2)PANC-1のSmad4恒常的Knock down株を樹立した。Microarray解析ではSmad4正常株とknock down株は大きく異なる標的分子群を示した。またPANC-1由来細胞のプロテオーム解析からも以下のようにSmad4を介さない標的分子の同定に成功した(Biochem Biophys Res Commun.2004 May 21;318(1):289-96)。この二次元電気泳動システムとスポット解析システム、MALDI-TOF/MSシステムは既に我々のグループ内では稼動している。以上抽出された分子群は細胞骨格、細胞周期の制御、酸化ストレスなどに関わるものであった。
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