| 研究概要 |
外科的に切除され、インフォームドコンセントの得られている特発性炎症性腸疾患(クローン病および潰瘍性大腸炎)ならびに、大腸悪性腫瘍で切除された腸管の健常部分を試料阻止、、得られた腸管をホモジェネートし、超遠心分離下後上清を-80℃で検討時まで保存した。
免疫吸着カラム作成
HiTrap-NHS-activatedカラムに抗ヒトHLA-DP抗体を同カラムに固層化した。カラムに流す直前に孔経22μmのミリポアフィルターメンブレンにて腸管ホモジェネートを濾過する。濾過された試料を抗ヒトHLA-DP固層化免疫吸着カラムに流し、試料中のHLA-DP抗原を免疫吸着カラムに固層化された抗HLA-DP抗体と抗原抗体反応により特異的に結合させ、免疫カラムを洗浄した後に、0.05 M diethylamine in 0.15 M NaCl containing 1% octylglycoside,0.05% sodium azide(pH 10.5)溶出溶液にて、同カラムからHLA-DP分子を溶出した。
HLA-DP分子から抗原ペプチドの溶出
前年度の計画で、ヒト腸管から精製されたHLA-DP分子から、その抗原決定基提示間隙に捕らわれている抗原ペプチドを、酸処理によって溶出する。試料溶液に2N HCIを加えpH 2.0とし、4℃にて24時間保存することによりHLA-DP分子の抗原提示間隙に結合しているペプチドがその間隙から解離してくる。次いで、分子量10,000の分子篩により低分子分画を分離し、凍結乾燥した。
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