| 研究概要 |
本研究は、発生の初期段階から心筋細胞に特異的に発現している転写因子Nkx2.5のプロモーター領域を解析し、Nkx2.5の上流因子を同定することにより、心筋細胞系列を決定する機構を解明することを目的としている。まず、我々はNkx2.5の上流60kbのゲノムDNAをBACライブラリーより分離し、約70種類のルシフェラーゼレポーターコンストラクトを作製した。これらのレポーター活性をラット培養心筋細胞を用いて調べ、活性が有意に高い領域を6箇所同定した。この6種類のDNAフラグメントをLacZレポーターコンストラクトに組み込み、トランスジェニックマウスを作製して、in vivoでの活性を調べた。その結果、3種類のDNAフラグメントがin vivoでも心筋細胞でプロモーター活性を示した。中でも特に上流5,2kb〜6,4kbのフラグメントはcardiac crescentからstraight heart tubeの時期に心筋細胞に強い活性を認めた。この部位のDNA配列を調べたところ、tandemに並ぶSmad結合部位を認め、その部分を取り除くと、in vitroでのレポーター活性は有意に低下した。これはBMPなどのSmadを介するシグナルがNkx2.5の初期発現に必須であり、心筋細胞系列の決定機構に関与していることを示唆する結果であった。現在、Smad結合部位を取り除いたコンストラクトでトランスジェニックマウスを作製し、in vivoにおいても活性が低下または消失することを確認中である。さらに、このフラグメント(上流5,2kb〜6.4kb)に種々のdeletionを入れて、詳細にレポーター活性をin vitroの系で調べたところ、Smad結合部位以外に強い活性を示す部位が1箇所あり、DNA配列を調べたところ、既知のコンセンサス配列が含まれいなかったので、現在、in vivoの系でこのレポーター活性を確認するとともに、いくつかのベイトを作製し、心筋細胞系列決定に関わる新規分子同定に向けて、yeast one-hybrid法にて未知の結合蛋白を検索中である。
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