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1)SDラット胸部大動脈由来平滑筋細胞vascular smooth muscle cell(VSMC)を酸化LDLで刺激し、0、1、2、4、6、12、24時間後の細胞を採取した。AGPC法によりtotal RNAを抽出し、20μgのtotal RNAを電気泳動する。Nylone filterに転写後、[α-^<32>P]-dATPにてラベルしたId3、p21WAF/Cip1、p27Kip1cDNAを用いてNorthern blottingを施行した。mRNA発現量の定量はBAS2000を用いて行った。2)同様に刺激した細胞をlysis buffer(500mM HEPES、5mM EDTA、50mM NaCl、1%Triton X、protease阻害剤)にて溶解後遠心し、上清をWestern blottingに使用する。3)上清をSDS-PAGEにて分離後、ニトロセルロース膜に転写し、抗Id3、抗p21WAF/Cip1、抗p27Kip1抗体を用いて蛋白の発現を検討した。
Id3mRNAの発現は、酸化LDL刺激2-6時間をピークに亢進が認められた。また、western blottingのいよりId3蛋白の増加も同様に認められた。しかし、p21WAF/Cip1、p27Kip1については、結果がまだ安定しておらず、再度検討中である。
Id3発現の上流のシグナル解析ではMAPK-kinase(MEK-1)阻害剤であるPD98059(25μM)、p38MAPK阻害剤であるSB203580(10μM)、JNK阻害薬である6-demethylaminopurine(DMAP)(1mM)PKC阻害剤である、GFXにて前処置し、Id3、p21WAF/Cip1、p27Kip1mRNA発現ならびに蛋白発現をNorthern blotting及びWestern blottingにて測定しているが、Id3発現をSB203580が抑制する傾向が認められている。しかし、データがやはり安定せず、現在問題点を探している。
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