| 研究概要 |
Fura-2でモルモット気管平滑筋の切片を処理し、等尺性張力と細胞内Ca^<2+>濃度(F_<340>/F_<380>)を同時記録した。脂質代謝産物であるスフィンゴシン1リン酸(S1P,10μM)を15-120分間曝露した後、メサコリン(MCh、ムスカリン受容体刺激薬)収縮は曝露時間依存性に増大した。1μM MChに対する反応性は約45%増加し、MChの濃度-反応曲線は約10倍左方に移動した。このS1P曝露後にみられるMCh収縮の増強効果は、低分子量G蛋白Rhoの標的酵素であるRho-kinaseの選択的阻害薬(Y-27632,0.01-1μM)の存在下で濃度依存性に抑制された。さらに、百日咳菌体毒素で6時間組織を処理し、受容体と三量体G蛋白Giとの共役を解除した条件下で同様の実験を行うと、S1P曝露後のMCh収縮の増強は起こらなかった。
比較的低濃度(<1μM)のS1Pを15分間以上曝露した後、1μM MChによる収縮に対するβアドレナリン受容体刺激薬であるイソプロテレノール(ISO)の弛緩作用は暴露時間依存性に低下した。この現象はY-27632の存在下では濃度依存性に抑制され、百日咳菌体毒素の処理でも同様に消失した。ISOを30分毎に10間繰り返し投与すると、MChに対するISOの抑制効果はしだいに減弱し、9回目にはISOの抑制効果はほとんど消失した。しかし、F_<340>/F_<380>の値は投与繰り返す毎に上昇した。この効果はY-27632では影響を受けなかったが、電位依存性Ca^<2+>チャネル阻害薬であるベラパミルで濃度依存性に抑制された。
ヒト気管支平滑筋の培養細胞を用いてRhoの活性化を調べるため、Rho-kinaseの特異的な標的であるミオシン脱リン酸化酵素のなかのmyosin phosphatase targeting protein(MYPT1)のリン酸化をウエスタンブロット法で測定した。SIPにより濃度依存性にMYPT1のリン酸化が増強し、そのリン酸化はY-27632で濃度依存性に抑制された。細胞増殖についてWST-1を用い、mitochondrial dehydrogenase activityを指標にして調べると、Y-27632の存在下では気管支平滑筋細胞の増殖は濃度依存性に抑制された。
|
