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本研究の目的は、低酸素応答で中心的な役割を果たすことが知られているhypoxia inducible factor-1 (HIF-1)が腎間質線維化の進展に関与することを明らかにすることである。
1.低酸素刺激と腎間質線維化の進展
C57BL/6マウスの一側尿管を結紮し、腎間質線維化モデルであるUUOマウスを作製した。Sham operation群、尿管結紮後4日目、8日目、12日目、および16日目の結紮側腎を摘出した後、Hypoxyprobe (Chemicon社)を用いて、腎組織中の低酸素領域を検出した。尿管結紮後8日目、12日目、および16日目の近位尿細管上皮細胞に強いHypoxyprobeの集積が認められた。したがって、間質線維化の進展に伴って尿細管上皮細胞は低酸素状態になることが明らかとなった。
2.初代培養の尿細管上皮細胞におけるEMTの誘導
Cre-loxPシステムを用いて、尿細管上皮細胞をLacZでパーマネント標識した遺伝子改変マウスの摘出腎を用いて、尿細管上皮細胞の初代培養を行った。1%O2培養下でEMTの誘導について検討した。蛍光抗体法で、LacZをCy3(赤)、FSP1をCy2(緑)で標識し、Cy3+.Cy2+細胞をEMT由来の線維芽細胞と判定した。低酸素培養3日後には、20%O2培養下に比して1%O2培養下では、EMT由来の線維芽細胞数が有意に増加していた。
3.Von Hippel-Lindau tumor suppressor (VHL)遺伝子改変マウスにおける腎間質線維化の検討
Cre-loxPシステムを用いて、尿細管上皮細胞で特異的にVHL遺伝子を欠損させたマウスを作製した。VHLは、HIF-1αのユビキチンリガーゼとして作用することが知られている。尿細管上皮細胞でVHL遺伝子をターゲッテイングすることで、尿細管上皮細胞特異的にHIF-1が安定化される。UUOマウスでVHL遺伝子改変マウスに腎間質線維化を誘導し、HIF-1が間質線維化の進展に関与するか否かを検討した。左腎尿管結紮後8日目に、両腎を摘出し、抗FSP1抗体を用いた酵素抗体法を実施した。結紮側腎でのFSP1陽性細胞数は著明に増加していたが、コントロールマウスにおけるFSP1陽性細胞数も増加しており、有意差が認められなかった。非結紮側におけるFSP1陽性細胞数は、コントロールマウスに比してVHL遺伝子改変マウスで有意に増加していた。
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