| 研究概要 |
1.発現ベクターの変更
プラスミドベクターとしてpBR322を用い、これにLacZおよびLTRを組み込んだものを発現ベクターとして作成し、使用してきた。しかしながら、β-ガラクトシダーゼ陽性筋線維が認められないため、同プラスミドをマウスの正常前脛骨筋に筋注し、そのβ-ガラクトシダーゼの発現を検討した。プラスミド100μg筋注を行った筋にβ-ガラクトシダーゼ陽性筋線維がわずかに認められた。このため、pCMVbetaを用いた発現ベクター作成した。
2.pCMVbetaを用いた発現ベクターの検討
プラスミド筋注量を10,50,100μgとしてマウス前脛骨筋に筋注し、そのβガラクトシダーゼの発現を検討した。10μgのプラスミドを筋注したマウス前脛骨筋にはβ-ガラクトシダーゼ陽性筋線維は認められなかったが、50,100μgのプラスミドを筋注したものにはβ-ガラクトシダーゼ陽性筋線維が認められた。この結果からpCMVbetaを用いた発現ベクターを使用することとし、プラスミド筋注量を50μgとした。
3.TGF-beta2のsenseおよびanti-senseを用いたdirect gene transfer
pCMVbetaを用いた発現ベクターにTGF-beta 2のsenseおよびanti-senseとLacZを導入したプラスミドを作製した。作製したプラスミド50μgをマウスの正常前脛骨筋に筋注し、それぞれの発現を確認するためにβ-ガラクトシダーゼ陽性筋線維の検討を行った。しかしながら、β-ガラクトシダーゼ陽性筋線維は認められなかった。マウスの週齢等を換えて検討したが、良い結果は得られなかった。この結果からTGF-beta 2 geneとLacZを同時に導入することで導入する遺伝子サイズが大きいために導入困難となっていることなどが考えられた。
4.RNA干渉を用いた検討
3.の結果を受け、RNA干渉を用いてTGF-beta 2欠損筋を作製することができないか検討することとした。これにより導入遺伝子のサイズの問題は解決できるものと考えられる。現在、TGF-beta 2 geneのどの部位のものでTGF-beta 2を抑制できるかを検討中である。
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