| 研究概要 |
我々の研究目的は,膵β細胞で構成的に発現され血流中に分泌されるレポーター分子を用いて,その血中濃度を測定することによりβ細胞量が推定できる動物モデルを作成することである.ここで必要な条件としては,1)トランスジーンの発現がβ細胞特異的であること.
2)発現が構成的(constitutive)で,種々の条件でも発現調節を受けないこと.
3)構成的に血中に分泌されること.
4)分泌されたマーカー分子は比較的安定で,かつ生理活性を持たないこと.
5)血中濃度の測定が容易であること.が挙げられる.
我々が本年度に行った研究では,これらを完全に充たすモデルを作成するための第一歩として,まず既報のラットインスリンII遺伝子のミニマムプロモーターをクローニングし、レポーター遺伝子プラスミドに挿入した。これをMIN6細胞、COS7細胞等にリポフェクション法にて導入し,ラットインスリンII遺伝子のミニマムプロモーターがβ細胞特異的に転写活性を有することを確認した。また、MIN6細胞において、生理的な範囲のグルコース濃度(5mM~25mM)下では転写活性の変化を認めなかった。次に発現ヒトアルブミン遺伝子のシグナル配列とヒトインスリン遣伝子のC-ペプチドをコードする部分を融合させたレポーター遺伝子にmyc tagを挿入したものを作成した。これをCMVプロモーターを用い、COS7細胞に発現させ、ウェスタンブロットで確認するとともに、メディウム中のヒトC-ペプチドを測定し、細胞から分泌されていることを確認した。
|
