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GAD65のcDNAを3つの部分に制限酵素を用いて切断し、それぞれのfragmentをpGEM-T vectorへ挿入し、N末端側をGAD65-N、中央部分をGAD65-M、C末端側をGAD65-Cと名付けた。また、蛋白の立体構造を保持させるためGAD65の欠落した部分に、GAD65のアイソフォームであるGAD67の適切な部分のcDNAを挿入し、GAD65-N/GAD67-MC、GAD65-NM/GAD67-C、GAD65-N/GAD67-M/GAD65-C、GAD67-N/GAD65-MC、GAD67-NM/GAD65-C、GAD67-N/GAD65-M/GAD67-Cの6つのキメラ分子を作成した。
これらのキメラcDNAを用いて、in vitro transcription/translation法により^<35>S標識蛋白を作成し、我々の開発したradioligand binding assayにより、健常人血清との反応を検討した。
そのデータを基にカットオフ値を設定し、GAD抗体陽性NIDDM患者血清を用いて、それぞれのキメラ分子に対する自己抗体の有無を検討した。その結果、GAD67およびGAD65のC末端部のみに反応する患者は、インスリン分泌が長期にわたり保持されることがわかった。これらの結果を踏まえ、まずGAD65-C部分に着目し、GAD65-CのcDNAをランダム化し、ファージDNAへ挿入、random peptide phage cDNA libraryを作成した。現在、他のfragmentについても同様にcDNAをランダム化し、ファージDNAへの挿入をおこなっている。
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