研究課題
基盤研究(C)
1型糖尿病におけるGAD65抗体のfine mappingを行うために、まずGAD65のcDNAを3つの部分に制限酵素を用いて切断し、それぞれのfragmentをpGEM-T vectorへ挿入し、N末端側をGAD65-N、中央部分をGAD65-M、C末端側をGAD65-Cと名付けた。また、GAD65のepitopeの立体構造を保持するためGAD65の欠落した部分に、GAD65のアイソフォームであるGAD67の適切な部分のcDNAを挿入し、GAD65-N/GAD67-MC、GAD65-NM/GAD67-C、GAD65-N/GAD67-M/GAD65-C、GAD67-N/GAD65-MC、GAD67-NM/GAD65-C、GAD67-N/GAD65-M/GAD67-Cの6つのキメラ分子を作成した。これらのキメラcDNAを用いて、in vitro transcription/translation法により^<35>S標識蛋白を作成し、我々の開発したradioligand binding assayにより、健常人血清との反応を検討した。そのデータを基にカットオフ値を設定し、我々が追跡調査している1型糖尿病およびGAD抗体陽性NIDDM患者の血清を用いて、GAD抗体エピトープの解析を行った。その結果、1型糖尿病およびGAD抗体陽性NIDDM患者のGAD抗体の主要なエピトープは、GAD65の中央部分(E1)とC末端部分(E2)に存在していることが明らかとなった。また、GAD抗体陽性NIDDM患者の追跡症例において、E2のみのエピトープを認識しているGAD抗体を有している患者では、E1を有している患者に比べインスリン治療へ移行するものの頻度が少なかった。これらの結果をもとに、GAD65のrandom phage display cDNA libraryを作成し、患者血清との反応を検討し、いくつかの特異的クローンを得た。これらの結果は、GAD抗体陽性NIDDM患者においてインスリン分泌不全への進行を早期に予知する手段としてエピトープ解析が有用であることを示唆している。
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