| 研究課題/領域番号 |
15591009
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| 研究機関 | 広島大学 |
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研究代表者 |
藤元 貴啓 広島大学, 大学院・医歯薬学総合研究科, 助教授 (00221549)
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| 研究分担者 |
藤村 欣吾 広島大学, 大学院・医歯薬学総合研究科, 教授 (80034114)
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| キーワード | ES細胞 / 巨核球 / 血小板 / プロプレートレット / 骨髄間質細胞 / シグナルシークエンストラップ / 接着因子 / 造血因子 |
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| 研究概要 |
マウスES細胞からin vitroでの巨核球分化、血小板産生系を確立した。
まずこの系を応用して、巨核球分化最終段階で血小板産生を促進する間質細胞を得る目的で、各種間質細胞、骨髄血管内皮細胞などの内皮細胞等との共培養を行って至適な細胞をスクリーニングしたが、大きな差は見られなかった。
そこで骨髄間質細胞に発現し、ES細胞および巨核球との相互作用に関わる蛋白の同定を行うことを目的に、シグナルシークエンストラップ(SST)法を用いて、骨髄間質細胞由来の膜蛋白、分泌蛋白のスクリーニングを行った。方法としては、間質細胞のmRNAより5'-richのcDNAを合成し、これをキャリア蛋白としてCD25の5'側を欠いたcDNAと融合させた形のライブラリーをレトロウイルスベクターを用いて作成した。このライブラリーを培養細胞に導入し、抗CD25抗体を用いたソーティングにより、陽性細胞を回収し、それぞれの細胞クローンからDNAを回収して、目的のインサートをPCRにて増幅し、膜蛋白、分泌蛋白をコードするクローンのcDNAを同定した。その結果、約200個のクローンが得られ、うち約20%が新規または未報告の蛋白であった。これらのリコンビナント体を作成し、相手となるES細胞および各分化段階の巨核球への結合を検討した結果、3つの陽性クローンを得た。予想されるアミノ酸配列から、このうち2つは細胞接着分子、1つは分泌蛋白である可能性が高く、それらをES細胞の分化系に添加した場合の影響について検討している。
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