血液細胞におけるミオシン・スーパーファミリーの機能解析

2003 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 15591024
• 研究機関: 北里大学
• 研究代表者: 東原 正明 北里大学, 医学部, 教授 (80165084)
• 研究分担者: 檀原 幹生 北里大学, 医学部, 助手 (80255348) ; 新津 望 北里大学, 医学部, 講師 (20256697) ; 堀江 良一 北里大学, 医学部, 助教授 (80229228) ; 高石 雅章 北里大学, 医学部, 助手 (10256307)
• キーワード: ミオシン / 遺伝子異常 / 軽鎖 / アイソフォーム / GFP / rho / rho-kinase / バキュロウイルス

研究概要

(1)古典的ミオシン軽鎖(20-kDa)アイソフォームの細胞内局在および機能解析:
Cell motility assayによる機能解析:血小板ミオシンの重鎖はIIAのみであることを利用して、アイソフォームMLC-2A, B, CのcDNAをE.coliへ遺伝子導入して蛋白を合成・精製し、exchange技法を用いて、ヒト血小板ミオシンを使用してIIA-MLC-2A, IIA-MLC-2B, IIA-MLC-2Cの3種のミオシンを再構成し、cell motility assay(アクチンを固定したスライドグラス上のミオシンの動態をビデオ撮影し、速度を測定)を行った。MLC-2CとMLC-2A,2Bとの間の有意な差をいとめ、さらに解析中
(2)巨大血小板減少症のMHC-IIA遺伝子異常の解析と変異MHC-IIAの機能解析:
本症で報告されているnon-muscle myosin重鎖IIA(MHC-IIA)の変異のうち頻度の高い3種類すなわちR702C, D1424H, E1841Kを選び、その変異体をバキュロウイルスによって発現させ変異ミオシンを生成し、ミオシンの機能を解析した。蛍光タンパク質GFP標識したミオシン変異体をHEL細胞(ヒト巨核球系白血病細胞株)に強制発現させて、TPAで分化誘導させ変異体によるproplatelet形成能の差異を詳細に調べる。光顕上では、突起形成の差を認め、今後、電顕上での詳細な検討を行う。
(3)Rho/Rho-kinaseのtranslocationにおける各ドメインの役割の解明
蛍光タンパク質GFPの変異体YFP, CFPで標識したrho, rho-kinaseのwild-typeおよび各ドメイン毎のmutantを培養細胞に発現させ、その局在変化をる。mutantとしては、kinase活性をなくすことが知られているK112A mutant、Rho binding能を潰したI1032A mutant、PHドメインを削除したmutantを用いた。Rho自体の細胞膜への局在変化がrho-kinaseの局在変化に影響を及ぼすかどうかを見るため、GTP結合型ではあるが、翻訳後修飾部位の変異体rho Q63L/C190RをRho-kinaseと共発現させてその局在を観察した。rho自体の膜への局在が必要であるためか、共発現したrho-kinaseは膜に局在しなかった。