|
マウスSCN2A遺伝子に目的とするアミノ酸置換を組み込むためのターゲティングベクター作成に取り組んだ。このアミノ酸置換はエクソン21内にある核酸アデニンをグアニンに点変異することにより生じる。そこで、エクソン21の前後のイントロンを含む713bpをPCRで増幅し、これをtemplateにしRandom Primer DNA Labeling Kitを用い、^<32>Pで標識したクローニングプローブを作成した。このプローブを用い、マウス脳由来cDNAをスクリーニングした。3次スクリーニングまで行い最終的に4クローンを単離し、高濃度ファージ溶液を得た。各ファージクローンを大腸菌LE392に取り込ませ培養増殖した後、Qiagen Lambda Midi Kitを用いプレートライセート法にてファージDNAを得た。このファージDNAを制限酵素Not 1で切断し、プラスミド(pBlueScript)にサブクローニングした。サブクローンを精製し、competent cellに形質転換した後、プレートに塗布培養した。そしてblue-white selection法にてサブクローンされたコロニーを得た。コロニーの一部をLE培地で震振培養し増殖させ、さらにアルカリ法にて純度の高いプラスミドを得ることができた。このプラスミドについてオートシークエンサーを用い核酸配列を決定し、目的とするエクソンを含んだフラグメントであることを確認した。
今後、ネオマイシン耐性遺伝子、lox P配列、HSV-TK遺伝子を単離されたDNAフラグメントに組み込んでターゲティングベクターを完成させる。
|
