| 研究概要 |
PCR-ELISA法の特異性の設定
はじめにPCR-ELISA法の特異性をみるために,患者初発時検体を二つに分け,一つは一方のプライマーの5'側をビオチン化し,もう一つはジゴキシゲニン化dCTPとともにPCRで増幅した.PCR産物を混合し加熱(95℃)により二本鎖DNAを変性した後,80℃にまで冷却して十分に再アニーリングさせた.これをストレプトアビジン化したELISA用プレートに添加することによりアビジン-ビオチン結合をおこし,十分に洗浄した後,ペルオキシダーゼ結合抗ジゴキシゲニン抗体と基質を加えて発色させ,その量を分光光度計で測定した.その結果,同一検体同士では十分な発色が得られるものの,異なった検体でも少なくない量の発色が検出された.これは本研究開始前に行った放射性同位元素を用いたパイロット研究の結果と同じであり,十分な特異性を得るためには,結合温度や頻回の洗浄だけでは不十分と考えられた.そこで他の因子(塩濃度や他の化合物(ホルムアミド,非特異的DNAなど)の添加)を加味した条件のもとで解析したところ,より特異的に発色する条件が得られた.
PCR-ELISA法の感度の設定
次に,初発時検体をコントロールDNAで段階的に希釈してものを対象として,上記の条件でPCR-ELISA法を行い,十分な感度が得られるかどうか検討した.その結果,10^<-2>までは特異的に検出できるものの,10^<-2>未満では非特的結合と同じレベルになってしまい,十分な検出感度が得られなかった.
臨床応用可能な検出レベルは10^<-3>とされており,現在の方法では不十分と考えられた.このため,種々のパラメーターを変更しつつ,さらなる検討を行っている.
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