色素細胞の肝細胞増殖因子シグナル伝達系におけるフロテインキナーゼCβ分子種の役割

2003 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 15591177
• 研究機関: 神戸大学
• 研究代表者: 岡 昌宏 神戸大学, 大学院・医学系研究科, 助手 (30252761)
• 研究分担者: 向井 秀幸 神戸大学, バイオシグナル研究センター, 助教授 (80252758)
• キーワード: 色素細胞 / 肝細胞増殖因子 / プロテインキナーゼC / シグナル伝達 / アデノウイルスベクター

研究概要

プロテインキナーゼCのα,β,δ,ε分子種の触媒活性欠失体・恒常的活性化体およびホスファチジルイノシトール3キナーゼ(PI3-K)のドミナントネガティブ体として働くΔp85(PI3-Kの触媒サブユニットp110とは結合できないがGab1とは結合しうるPI3Kの調節サブユニットp85)に対するアデノウイルスベクターを次の順序で作製した。まず、それぞれの蛋白に対するcDNAをシャトルベクターpAdCMVに組み込み、これをアデノウイルスゲノムのE1及びE3領域を欠くlarge fragment dl7001と共にリン酸カルシウム法で293細胞に同時にトランスフェクトした。293細胞はヒト胎児腎細胞がアデノウイルスのE1領域遺伝子によりトランスフォームして樹立された細胞株で、この細胞株においてはE1遺伝子が発現しているので、細胞内でシャトルベクターpAdCMVとlarge fragment dl7001が相同組み換え(homologous recombination)を起こすと、その組み換えウイルスはE1遺伝子を持たないにもかかわらず、293細胞では野性株と同様に増殖し、かつ目的遺伝子を保持している。目的遺伝子を保持する組み換えアデノウイルスをサザンブロットによりスクリーニング・確認後、精製操作を行い、最終的に高力価の組み換えアデノウイルスベクターを得た。各種色素細胞にそれぞれの蛋白に対するアデノウイルスベクターを感染させた後、ウエスタンブロットを行い目的蛋白の発現を確認した。さらにΔp85については発現した細胞をインスリン刺激した際にPI3-K活性化が抑制されることを確認した。

研究成果

• [文献書誌] Oka, M., Kageshita, T., Ono, T., Goto, A., Kuroki, T., Ichihashi, M.: "Protein Kinase C α Associates with Phospholipase D1 and Enhances Basal Phospholipase D Activity in a Protein Phosphorylation-Independent Manner in Human Melanoma Cells"J.Invest.Dermatol.. 121・1. 69-76 (2003)
• [文献書誌] Li, G., Kalabis, J., Xu, X., Meier, F., Oka, M., Bogenrieder, T., Herlyn, M.: "Reciprocal regulation of MelCAM and AKT in human melanoma"Oncogene. 22・44. 6891-6899 (2003)
• [文献書誌] Oka, M., Okada, T., Nakamura, S., Ohba, M., Kuroki, T., Kikkawa, U., Nagai, H., Ichihashi, M., Nishigori, C.: "PKCδ inhibits PKCα-mediated activation of PLD1 in a manner independent of its protein kinase activity"FEBS Letters. 554・1-2. 179-183 (2003)