| 研究課題/領域番号 |
15591292
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| 研究機関 | 横浜市立大学 |
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研究代表者 |
中神 佳宏 横浜市立大学, 医学部, 助手 (80347301)
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| 研究分担者 |
井上 登美夫 横浜市立大学, 医学研究科, 教授 (80134295)
荻野 伊知朗 横浜市立大学, 医学部, 助教授 (20275035)
大村 素子 横浜市立大学, 医学部附属病院, 助手 (70244506)
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| キーワード | アポトーシス / 放射線感受性 / DNase II / 遺伝子導入 / PCR法 / エレクトロポレーション / ソノポレーション / アネキシンV |
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| 研究概要 |
放射線高感度群(HL60、MOLT-4等)の細胞群、及び放射線低感度群(HeLa、A549等).の細胞群を液体培地上で培養後、それぞれの細胞群の対数増殖期に低線量(1Gy〜5Gy)のγ線を照射した。高感度群がアポトーシスを生じるまで一定期間(24時間〜72時間)37℃、5%CO2下でインキュベート。それぞれの細胞群の非照射群と照射群のそれぞれにつき、1×10^6個取り出し、Dounceホモジェナイザーで破砕後、4℃、1.500rpmで遠心、上清を細胞質分画とする。次にペレットを回収しlysisバッファーで洗浄後、核抽出バッファーでペレットを溶解、14.000gで15分遠心、上清を核抽出物とする。それぞれの細胞質分画、および核抽出物においてウエスタンブロット法を施行し、DNaseIIの発現量を比較した。放射線高感度群においてはDNaseIIの発現量が低感度群に比し、多かった。
各細胞群のアポトーシスの確認作業として、アネキシンVを用いたフローサイトメトリー、TUNEL法を用いたフローサイトメトリー、電気泳動法によるDNAラダーの確認等により行なった。更に、適切なプライマーを用いて、PCR法によりDNaseII遺伝子に関するcDNAを作成。放射線低感度の細胞群にそれぞれトランスフェクション試薬であるjetPEI Tetramethyl Rhodamine(フナコシ社製)を用いてDNaseII遺伝子を各細胞群に導入、24時間後に共焦点蛍光顕微鏡で観察して導入効果を確認した。但し、導入効率が非常に悪く、DNaseIIを強制発現することが困難であった。従って、現在、他の方法(エレクトロポレーション法やソノポレーション法等)によって試行中である。
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