| 研究課題/領域番号 |
15591726
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| 研究機関 | 山形大学 |
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研究代表者 |
高橋 俊文 山形大学, 医学部, 助手 (20302292)
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| 研究分担者 |
五十嵐 秀樹 山形大学, 医学部, 助手 (80333970)
高橋 一広 山形大学, 医学部, 助手 (20292427)
倉智 博久 山形大学, 医学部, 教授 (40153366)
小島原 敬信 山形大学, 医学部, 助手 (20344806)
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| キーワード | エストロゲン / 選択的エストロゲン受容体モジュレーター(SERM) / GFP / FRET |
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| 研究概要 |
今回の研究は、選択的エストロゲン受容体モジュレーター(SERM)の臓器特異性を転写共役因子との相互作用の観点からFRET解析を行い明らかにすることを目的とした。今年度は、ERα融合GFPタンパク質の作成を行い、GFP-ERαの局在および機能について解析を行った。GFP-ERαのキメラコンストラクトを作成後、ERαを持たないCOS-7 cellへlipofection法を用いて遺伝子導入し、蛍光顕微鏡を用いて細胞内の局在を観察した。GFP-ERαは核内に発現が認められた。次にエストロゲン応答性をみるためにCOS-7 cellに遺伝子導入後luciferase法を用いERE-tkのプロモーターアッセイを行った。コントロールと比較して約8倍の活性比が認められた。さらに、ligand投与によるGFP-ERαの核内分布の変化を共焦点レーザー顕微鏡にて観察した。Ligandはエストロゲン及びSERMであるタモキシフェン、ラロキシフェンを用いた。これまでの報告同様、エストロゲン、タモキシフェン、ラロキシフェン投与後10分以内にGFP-ERαの核内分布は顆粒状に変化した。以上より、今回作成したGFP-ERα融合タンパク質は機能的にERαと同様の性質を有していることがわかった。また、AF-2ドメインの欠失したERαを用いて、GFP-mtERαのキメラコンストラクトを作成し、GFP-ERαと同様に細胞内局在、ERE-tkのプロモーターアッセイ、ligandに対する核内分布の変化を観察した。AF-2ドメインを欠失したGFP-mtERαはエストロゲン、SERMに対する応答性は観察されなかった。次年度は、転写共役因子融合GFPタンパク質を作成し、今年度作成したGFP-ERαとの相互作用についてFRET解析を行う予定である。
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