| 研究課題/領域番号 |
15591788
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| 研究機関 | 兵庫医科大学 |
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研究代表者 |
堀内 功 兵庫医科大学, 医学部, 助手 (70340974)
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| 研究分担者 |
澤井 英明 兵庫医科大学, 医学部, 講師 (80215904)
小森 慎二 兵庫医科大学, 医学部, 助教授 (60195865)
赤谷 昭子 (長谷川 昭子) 兵庫医科大学, 医学部, 講師 (50212402)
香山 浩二 兵庫医科大学, 医学部, 教授 (00068496)
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| キーワード | 低アルカリファスファターゼ症 / 着床前遺伝子診断 / 受精卵診断 / 出生前診断 / 組織特異的アルカリフォスファターゼ |
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| 研究概要 |
組織非特異的アルカリホスファターゼTNSALP遺伝子の変異がすでに同定されている保因者の白血球細胞1個を試料として用い、この細胞から抽出したゲノムDNAを用いて、PCR法にて遺伝子の増幅・検出・変異の同定が可能であるかどうかを検討した。試料は静脈血でこれをリンホライトリンパ球分離液を使用して、リンパ球を回収した。PBS洗浄後にマイクロマニピュレーターを用いて、白血球1個を回収し、溶解液4μlを入れたPCR用チューブに移し、この状態で65℃で10分間加温して細胞を融解してゲノムDNAを溶出させた。ついで94℃にて10分間加温して溶解液中のproteinase Kを不活性化させ、その後4℃に低下させて、そのまま次のステツプに進むか、-20℃で凍結保存した。
次にTNSALP遺伝子のゲノムDNAをPCR法にて増幅した。ゲノム遺伝子は12エクソンに分かれているため、PCR法に用いるプライマーはそれぞれのエクソンについて合成する必要がある。しかも細胞1個にはTNSALP遺伝子は1対(2個)しか含まれていないため、これを遺伝子増幅するためには増幅対象領域についてPCR反応を繰り返して2度行ういわゆるnested PCR法が必要となる。この方法に必要なTNSALP遺伝子のプライマーの塩基配列はすでに報告されているので、これらの情報を用いて、細胞1個より増幅可能な条件を検討した。増幅された遺伝子がTNSALPであるかどうかについてはそれぞれの増幅された遺伝子内に存在する制限酵素部位が、既知のTNSAPLの遺伝子配列と一致するかどうかで判断した。
これによると同じ増幅法であっても細胞融解の方式によって増幅の程度の差が出ることが判明した。すなわち蛋白融解酵素を用いたものよりもアルカリ溶解法を用いた方が正確な増幅が期待できることがわかった。
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