| 研究概要 |
1)(キメラ蛋白作製)PCRにより、CH1からCH3までのヒトIgG Fc部位のcDNAと、CH2からCH4までのIgE Fc部位のcDNAを得て、ライゲーションしたヒトIgG-IgEのキメラ遺伝子をpAN発現ベクターに組み込んだ。エレクトロポレーションにてSP2/0細胞に遺伝子導入する。この細胞をIMDM液中でFCSを枯渇させながら10日間培養し、Glutamaxで細胞を死滅させ、1〜2Lの上清を得る。抗ヒトIgE抗体カラムによりヒトIgG-IgEのキメラ分子を精製した。
2)(ヒトB細胞のIgEクラススイッチ)ヒトB細胞をIgG-IgEのキメラ分子で前処理し、IL-4及び抗CD40抗体で刺激した。刺激後2日後と4日後にRNAを採取し、ε germline transcripts(εGTs)とswitch circle transcripts(CTs)の発現をそれぞれ検討した。刺激7日後、genomic DNAを用い、digestion-circularization PCR(DC-PCR)にて、IgEクラススイッチを観察した。ヒトB細胞において、IL-4及び抗CD40抗体刺激によるIε-Cμ,Iε-Cε2,Sμ-Sεは、GE2により濃度依存性に抑制された。ヒトB細胞において、IL-4及び抗CD40抗体刺激によるクラススイッチは、GE2により抑制されたが、sCD23にてこの効果は減少し、CD23依存性であることが判明した。
3)(GFP発現ベクターとクラススイッチ)ヒトSμとSγの間にGFPを逆方向に存在させ、Sμ-Sγのrecombinationの際にはSV40 promotor、Sμ-Sγのinversionの際にはCMV promotorが働きGFPが発現するベクターをヒトB細胞株R2G6にエレクトロポレーションにて遺伝子導入した。IgG-IgEのキメラ分子を前処理し、IL-4及び抗CD40抗体で刺激し5日後に、flow cytometlyにてクラススイッチを定量比較した。ヒトB細胞株R2G6を用いた実験でも、GFP陽性細胞数の割合は、5μg/mlのGE2により45%減弱した。
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