| 研究課題/領域番号 |
15591862
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| 研究機関 | 佐賀大学(医学部) |
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研究代表者 |
小林 かおり 佐賀大学, 医学部, 講師 (60325595)
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| 研究分担者 |
小林 博 佐賀大学, 医学部, 助教授 (00215360)
沖波 聡 佐賀大学, 医学部, 教授 (70089100)
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| キーワード | セリンプロテアーゼインヒビター / 融合タンパク質 / 免疫組織化学 / 網膜の分化 |
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| 研究概要 |
我々がニワトリ胚網膜色素上皮細胞の特異的な遺伝子として単離したpP344遺伝子は、分化、形質転換に深く関わり、セリンプロテアーゼインヒビター類似配列を有する。PP344タンパク質の機能を解明するために、テトラサイクリンを用いた哺乳類細胞発現システムを用いて、PP344タンパク質を産生した。開始コドンを含む1648bpのpP344cDNAを、発現用ベクターpcDNA4/TO/myc-Hisに組み込んだ。リポフェクトアミン2000を用いてTetリプレッサーを恒常的に発現するHeLa細胞にトランスフェクションさせた。テトラサイクリンにてPP344-His融合タンパク質を発現させ、ウェスタンブロット法を施行した。68kDaのPP344-His融合タンパク質の発現が認められた。ゼオシンを用いて安定細胞株を樹立した。Ni-NTAマグネティックアガロースビーズを用いPP344-His融合タンパク質を精製した。今後我々は、PP344タンパク質の網膜の発生、分化における役割を解明するために、網膜の培養系を確立し、PP344タンパク質の網膜の分化に対する影響について検討する予定である。
PP344タンパク質のマウス網膜内分布については、2003年日眼総会で報告した。抗PP344抗体を用いた免疫組織化学法を生後8週目マウスの眼内に対して施行した。網膜色素上皮、網膜視細胞層から神経節細胞層に及んで染色がみられた。さらにpP344mRNAのマウスの眼内分布の同定のために、ジコギシゲニン標識したpP344プローブを作製し、マウス網膜にてin situハイブリダイゼーションを試みた。現在in situハイブリダイゼーション条件等を検討中である。
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