網膜色素上皮に特異的な多型プロテアーゼpP344遺伝子産物の血管新生阻害作用

2004 年度 研究成果報告書概要

• 研究課題/領域番号: 15591863
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: 眼科学
• 研究機関: 佐賀大学 (2004); 佐賀大学(医学部) (2003)
• 研究代表者: 沖波 聡 佐賀大学, 医学部, 教授 (70089100)
• 研究分担者: 小林 博 佐賀大学, 助教授 (00215360) ; 小林 かおり 佐賀大学, 講師 (60325595)
• 研究期間 (年度): 2003 – 2004
• キーワード: 網膜色素上皮 / 血管新生 / 血管内皮管腔形成

研究概要

pP344遺伝子は、ニワトリ胚網膜色素上皮に特異的に発現するserpin型及びkazel型セリンプロテアーゼ配列を持つ遺伝子である。カニクイザルの網膜色素上皮よりRNAを精製し、ヒトpP344mRNAに対するプライマーを作製しRT-PCRを施行し、アガロースゲル電気泳動で1バンドが検出された。抗pP344抗体を用いた免疫組織学法をカニクイザル網膜において施行した。pP344タンパク質の発現が脈絡膜、網膜色素上皮、視細胞層、内顆粒層、神経節細胞層にかけて認められた。
pP344-His融合タンパク質を精製し,pP344遺伝子産物の血管新生に対する影響を検討した。pP344cDNAを組み込んだ発現ベクターより強制発現させたpP344-His融合タンパク質を精製し、ヒト血管内皮管腔形成への影響を検討した。24ウェルプレート上でヒト血管内皮細胞と繊維芽細胞とを血管新生専用培地を用いて共培養させる血管新生キット(KURABO)を使用し、pP344精製融合タンパク質を添加した。添加11日目エタノール固定し、1次抗体としてマウス抗ヒトCD31抗体、2次抗体としてアルカリフォスファターゼ抱合ヤギ抗マウスIgG抗体を反応させた後、BCIP/NBT溶液で発色した。画像処理定量ソフトウエアにより管腔形成を4個のパラメーター(AREA, LENGTH, JOINT, PATH)でスコアリングして、pP344タンパク質の血管内皮管腔形成に対する効果を検討した。pP344融合タンパク質の添加にて、ヒト血管内皮管腔の長さ、面積が濃度依存性に増加し、管腔形成を促進した。pP344融合タンパク質がヒト血管内皮管腔形成を促進することが示唆された。血管新生に対するさらなる機能の解明が重要であると考えられた。