| 研究概要 |
New Zealand白色兎の角膜実質内に臨床分離株の緑膿菌(2X10^4CFU)を接種し、経時的(3,9,12,15,18,24,72時間)に眼摘を行い、matrix metalloproteinase (MMP)-2,MMP-9およびtissue inhibitor of MMP (TIMP)-1,TIMP-2の発現を免疫染色にて検討した。さらに、経時的に角膜切除を行い、角膜中に産生されるMMPなどのプロテアーゼをカゼインやゼラチンを基質としたザイモグラフィーで解析した。また、角膜内に発現されるTIMP-1,-2をELISAにて測定した。さらに、MMP-2,MMP-9,TIMP-1およびTIMP-2のmRNA発現をRT-PCRにて解析した。その結果、ザイモグラフィーではMMP-2は接種早期より検出され、その後殆ど変化がみられなかったが、MMP-9は接種15時間後より検出され72時間に向け、増強し、活性型も検出された。また、接種18時間以降に25kDaのカゼイナーゼが検出された。免疫染色では、MMP-2は接種早期から角膜実質細胞に染色像を認め、一方、MMP-9は角膜細胞にも染色性が認められたが、接種15時間以降に主として浸潤した好中球に強い染色像を認め、経過とともに増強した。TIMPでは、TIMP-2は全経過を通じて検出限度以下であったが、TIMP-1は接種15時間より検出され、経過とともに増強した。MMP-2およびTIMP-2 mRNAの発現は初期よりみられたが、ほぼ一定で、一方、MMP-9,TIMP-1mRNAは感染24時間以降に発現が亢進した。その後、炎症性サイトカイン(IL-1β,IL-8,MCP-1,TNF-a)の発現亢進が免疫染色およびELISAにて確認された。これらの結果はウサギにおける実験的緑膿菌性角膜炎において、主たる潰瘍形成の要因の一つはMMP-9(活性型)であり、その由来として角膜細胞よりも浸潤してくる炎症細胞(大半は好中球)が考えられた。炎症細胞浸潤には炎症性サイトカインが関与しており、また、MMPの発現亢進にも関与していると考えられ、最終的にはMMP/TIMPのバランスが崩れて(MMPが相対的に大)潰瘍形成を生じると考えられる。
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