| 研究概要 |
OCZF(Osteoclast zinc finger protein)のマウスのホモログであるLRF(Leukocyte-related factor)のゲノムをBACクローンから単離し制限酵素で切断しmapを作成した。と同時に、southern解析を行い制限酵素切断パターンを確認した。さらにこれらの情報をもとに3種のターゲットベクターをデザインし、それぞれのターゲットベクター及びそのコントロールベクターを作成した。それぞれのターゲットベクターについて10個程度のプライマーをデザインし、希釈したコントロールベクターを用いて種々の条件でPCRを行い、fgオーダーでPCRが可能なターゲットベクターを選出した。さらにこのベクターについていくつかのプローブ5'側及び3'側それぞれを作成し、southern解析において使用可能なプローブを選出した。
ES細胞の培養を始める前に7フィーダー細胞をCD-1妊娠マウスの15日の胎児から分離した。フィーダー細胞を増やしマイトマイシンCで2時間半処理したもののうえにES細胞(E14)をまき毎日medium交換を行いながら培養・継代を行い増やした。この細胞にlinealizeしたターゲットベクターを添加後Bio-Rad Gene Pulserを用いて340KV,250μFDの条件で遺伝子導入した。この細胞をgelatinコートしたdich10枚にまき2日後G418を300μg/mlとなるように添加し毎日medium changeをしながら8日培養した。500個コロニーをピックアップしPCRでチェックした結果8個の陽性クローンが得られた。これらのクローンをさらに増やしsouthern解析を行った結果6個のES-LRF(+/-)クローンが得られた。現在これらのクローンを用いてdouble knockout細胞及びノックアウトマウス作成の準備を進めている。
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