| 研究概要 |
テタヌス毒素は神経伝達物質の放出に関与するVAMP-2を加水分解し、神経伝達物質の放出を停止させるが、神経突起の伸張は正常に行われることから、神経突起の伸張に関わる開口分泌にはテタヌス毒素非感受性のVAMP(TI-VAMP/VAMP-7)の関与が示唆されている。TI-VAMP/VAMP-7の役割を明らかにするため、まず、VAMP-2、VAMP-7のGFP融合タンパク質をヒト唾液腺由来の培養細胞であるHSY細胞とPC12細胞に発現させ、それらの発現部位と動態を共焦点レーザー顕微鏡を用いて比較検討した。同時に、分泌過程の可視化と定量化のため、ヒト成長ホルモンとそのGFP融合タンパク質を同じ細胞に発現させ、分泌量をELISA法で測定するとともに分泌顆粒の動態を観察した。その結果、HSY細胞の構成的な分泌にVAMP-7が何らかの役割を果たしていることが示唆された。次に、HSY唾液腺由来細胞を用い、ヒト成長ホルモン(hGH)の構成的な分泌におけるVAMP-2の役割を検討した。まず、VAMP-2のmRNA発現を検討したところ、HSY細胞にも発現が認められ、PCR産物の塩基配列から、間違いなくヒトのVAMP-2であることが確認された。次に、VAMP-2-GFPとhGHをHSY細胞に共発現させたところ、VAMP-2がよく発現している細胞ではhGHを含むvesicleが極めて少なく、VAMP-2-GFPとhGHがともに局在するvesicleはほとんど認められなかった。このことは(1)VAMP-2は構成的な分泌に関与しない、(2)VAMP-2が関与する構成的な分泌は極めて速いためvesicleの検出が困難、という二つの可能性が考えられた。後者の可能性を検討するため、HSY細胞に低温処理を行った。20℃2時間の低温処理後37℃に戻した後、時間を追って細胞を固定し、それらの発現部位を共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察した。その結果、37℃に戻してから5,15,30分後の細胞内に、VAMP-2-GFPとhGHを同時に発現する小さなvesicleが多数認められた。これらの実験結果から、VAMP-2がv-SNAREとして極めて速い構成的な分泌に関与している可能性が強く示唆された。
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