機能性免疫グロブリン融合タンパクの歯周ポケット貼剤としての有用性解析

2003 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 15591995
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 秋山 茂久 大阪大学, 歯学部附属病院, 助教授 (00283797)
• 研究分担者: 村上 旬平 大阪大学, 歯学部附属病院, 助手 (70362689) ; 天野 敦雄 大阪大学, 大学院・歯学研究科, 教授 (50193024) ; 森崎 市治郎 大阪大学, 歯学部附属病院, 教授 (30116115)
• キーワード: Porphyromonas gingivalis / 歯周病 / 遺伝子導入 / 機能性免疫グロブリン融合タンパク / 線毛 / フィブロネクチン / Fc融合タンパク質 / 除菌療法

研究概要

本研究は、歯周病菌Porphyromonas gingivalisのII型線毛をターゲットとした除菌療法を歯周治療に応用するために機能性免疫グロブリン融合タンパクの歯周ポケット貼剤モデルを構築し、その有用性を解析することを目的としている。そこで、先ず、II型線毛タンパクに強い付着特性を有するヒトフィブロネクチンとの線毛との結合領域の同定から研究を開始した。
1.GST-fusionリコンビナントフィビロネクチンフラグメントの作製
フィブロネクチンの線毛との結合領域を同定するために、フィブロネクチン全タンパクをカバーする10の分割フラグメントを作製し、精製した。
2.各フィビロネクチンフラグメントとP.gingivalis線毛との結合親和性の評価
ドットブロットアッセイおよびBIACOREを用いた評価により、フィブロネクチンタンパクの特定領域がP.gingivalis線毛に強い結合親和性を有することが示された。
3.Fc融合タンパク質の大量発現系の構築
マウス脾細胞cDNAライブラリを用いて、IgG1/Fcフラグメントをコードする遺伝子断片とP.gingivalis線毛特異的親和性を有する領域をコードする遺伝子断片をPCR法によりクローニングした。得られた遺伝子断片の塩基配列を確認後,まず、フィブロネクチン遺伝子断片のpSecTag2/hygベクターへのクローニングを行った。このベクターを用いることにより、分泌タンパクとして精製する事が可能となる。さらに,フィブロネクチン遺伝子断片の3'側にマウスIgG1 Fcフラグメントの遺伝子断片を連結させ、両融合タンパクをコードする遺伝子断片を作製した。
次年度は、作製したフィブロネクチン-Fc融合タンパク遺伝子をCHO細胞に導入させ、培養上清をSDS-PAGE上に展開し,抗マウスFcフラグメント抗体を用いて発現の確認を行う。その後、目的とする機能評価を継続する予定である。

研究成果

• [文献書誌] Amano A, Nakagawa I et al.: "Variations of Porphyromonas gingivalis fimbriae in relation to microbial pathogenesis"Journal of Periodontal Research. 39(2). 136-142 (2004)
• [文献書誌] Okahashi N, Inaba H, Amano A et al.: "Porphyromonas gingivalis induces receptor activator of NF-κB ligand expression in osteoblasts through activator protein-1 pathway"Infection and Immunity. 72(3). 1706-1714 (2004)
• [文献書誌] Inaba H, Kawai S, Nakayama K, Okahashi N, Amano A: "Effect of enamel matrix derivative on periodontal ligament cells in vitro is diminished by Porphyromonas gingivalis"Journal of Periodontology. (In press). (2004)
• [文献書誌] Nakano K, Kuboniwa M, Amano A et al.: "Comparison of inflammatory changes by Porphyromonas gingivalis with distinct fimA genotypes in a mouse abscess model"Oral Microbiology and Immunology. (In press). (2004)
• [文献書誌] Yasui, E.M., Kimura, K.R., Kawamura, A., Akiyama, S., Morisaki, I.: "A modified oral screen appliance to prevent self-inflicted oral trauma in an infant with cerebral palsy : a case report"Oral Surg.Oral Med.Oral Pathol.Oral Radiol.Endod.. (In press). (2004)
• [文献書誌] Morisaki I: "Pharmacological Behavior Guidance in Dentistry for Persons with Special Needs : An Alternative Approach to Patients with Autistic and Related Communication Disorders Using a Visual Guide"Dentistry in Japan. (In press). (2004)
• [文献書誌] 森崎市治郎, 秋山茂久 他: "最新歯科衛生士教本 障害者歯科"医歯薬出版株式会社. 174 (2003)