| 研究課題/領域番号 |
15603005
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
細胞死(アポトーシス)
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| 研究機関 | 東京慈恵会医科大学 |
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研究代表者 |
秋山 暢丈 東京慈恵会医科大学, 医学部, 助手 (00338865)
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| 研究分担者 |
渡辺 美智子 東京慈恵会医科大学, 医学部, 助手 (10158660)
山田 尚 東京慈恵会医科大学, 医学部, 助教授 (20130213)
近藤 科江 京都大学, 医学部, 助教授 (40314182)
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| 研究期間 (年度) |
2003 – 2004
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| キーワード | アポトーシス / TGF-β |
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| 研究概要 |
TAIPファミリーが関与するアポトーシスの情報伝達の解明の為、ヒトTAIP-2/3/12及びマウスのファミリー全てのモノクローナル及びポリクローナル抗体を作成を第一目標とした。大腸菌及び真核細胞系によりTAIP-12を除く、ヒト及びマウスのTAIP蛋白質を全長蛋白質として発現させ、タグを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、可溶化された蛋白質を得た。この蛋白質を抗原としてポリクローナル抗体を作成すると共に、マウスに免疫しTAIP-2及びTAIP-3を検出するモノクローナル抗体の作成した。得られた抗体を用いて、TGF-βによるアポトーシスに関係すると思われる細胞におけるアポトーシスとTAIPの発現量、及び構造との関連を調べた。
上記の解析のためマウスの肝臓の実質細胞を定的に分離する手法を検討し、胎児及び成体の肝臓実質細胞を得て、この細胞を用いてTGF-βとアポトーシスと発現量を解析した。
TAIP-2/3は強制的に過剰発現させるとアポトーシスを誘導するが、そのメカニズムを解析するために、蛍光蛋白質及び薬剤耐性遺伝子と融合し、ひとつの蛋白質として発現する融合蛋白質を構築し、遺伝子工学的にcDNAにランダムに変異を導入した後、真核生物発現ライブラリーとして構築した。このライブラリーをHEK-293細胞に導入し、薬剤耐性、蛍光を指標にアポトーシス活性が消失した変異体を単離するスクリーニング系を開発し、スクリーニングを行った。
また、TAIP-3の機能を調べるため、ノックアウトマウスを作成すべく、ノックアウトベクターを構築した。
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