寿命関連遺伝子clk-1のアポトーシス制御

2003 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 15603009
• 研究機関: (財)東京都高齢者研究・福祉振興財団
• 研究代表者: 高橋 真由美 (財)東京都高齢者研究・福祉振興財団, 東京都老人総合研究所・分子老化研究グループ, 研究助手 (50133632)
• 研究分担者: 白澤 卓二 財団法人東京都高齢者研究, 福祉振興財団, 部長 (80226323)
• キーワード: アポトーシス / 長寿関連遺伝子 / ミトコンドリア / CoQ / Tet-offシステム

研究概要

1.clk-1欠損マウス胎児におけるミトコンドリアの呼吸機能およびアポトーシスによる細胞死
clk-1欠損マウスの胎生致死の原因がアポトーシスであるか検討した。
clk-1遺伝子産物はミトコンドリア呼吸鎖の電子伝達体であるCoQの合成酵素であり、clk-1欠損マウスにはCoQが存在しない。そこでミトコンドリア膜電位を測定するため胎生10.5日目の胎児由来細胞をJC-1で蛍光染色した。ホモマウス由来細胞(ホモ細胞)は、ミトコンドリアの膜電位を維持してはいるものの野生型に比べ有意に低いことがわかった。次にホモ細胞でミトコンドリア由来のアポトーシスが起きている可能性を検討する為、抗チトクロームC抗体で免疫細胞染色した結果ホモ細胞ではチトクロームCの細胞質内局在が認められた。さらに胎児細胞をヘキスト染色した結果アポトーシスに特徴的な核の断片化が確認され、胎児の組織切片においても、TUNEL陽性細胞が多数観察された。これらの結果から、clk-1欠損マウスはミトコンドリアの機能低下に由来するアポトーシスが全身の細胞に誘導され、胎生致死となることが強く示唆された。
2.Tet-offシステムを用いたclk-1遺伝子発現改変マウスの作成
CLK-1タンパクの発現を人為的に制御することによりCoQ合成を調節可能にしたトランスジェニックマウスの作成のためにTgPrP tTA、TgCoq7TRELacZの2つのベクターを作製した。前者はプリオンプロモーターにテトラサイクリン制御性転写活性化因子をクローニングし、後者はテトラサイクリン応答性因子下にclk-1遺伝子、lac Z遺伝子をクローニングしたもので、これらをそれぞれ直鎖状DNAにして精製したものをDNA微量注入法にて導入した。発生した16個体のうち4個体にトランスジーンが確認され、現在飼育中である。