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本研究では組織幹細胞において発現を維持できるレトロウイルスベクターの開発を目指して、マウス白血病ウイルス由来のMLVレトロウイルスベクターがマウスES細胞において不活性化される現象の分子的基盤の解明を試みた。クロマチン構造変換因子SWI/SNF複合体のATPaseサブユニットであるBrmの発現を欠くヒト癌細胞群においてMLVベクターの発現が抑制されることを、これまでに我々は明らかにして来た。Polycomb複合体構成因子YY-1のDNA結合配列を破壊したベクターの使用或いは異所的なBrmの発現によってその発現抑制が解消されることから、ES細胞におけるMLVの不活性化にも同様な機構が関与するか否かについて先ず解析した。ES細胞がBrmの発現を欠くことを確認した後、LTR上のYY1結合配列を破壊したMLVベクターのES細胞における発現を検討したが、YY1配列の破壊はMLVの不活化を解除することはなかった。また、ES細胞で発現可能なMSCVベクターのYY1配列の破壊についても発現の量と維持に対して有意な効果は無く、Polycomb/tritholax因子の積極的な関与は認められなかった。ES細胞においてMSCVベクターは発現が許容されるが、長期間培養中に漸次発現が失われることが知られているので、次にこの長期的な発現抑制の原因となる分子機構の探究を行った。Cell Sorterを用いた発現解析によって、この発現抑制は発現強度が徐々に低下することによって引き起こされているのではなく、All-or-Noneに発現を突然消失していることを確認した。次にProvirusのDNAメチル化の関与を検討しProvirus DNAのメチル化が発現の抑制と極めて高い相関があることを見い出した。Provirus領域のヒストン修飾の関与も検討したが、種々のヒストンH3・H4リジン及びアルギニン残基特異的アセチル化及びメチル化修飾抗体のクロマチン免疫沈降実験では発現抑制との間に強い関連性を見い出すことはなかった。また、重感染実験を行い同一細胞内の異なるprovirusの発現抑制は互いに独立であることも確認し、MSCVの発現抑制はpromoter-specificな転写抑制に依るものと結論された。以上の結果から総合して、MSCVの長期的な発現抑制においてProvirus DNAのメチル化は中心的な役割を果たしていることを示すことが出来たと考えられる。
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