| 研究概要 |
放射線によるゲノム障害の修復機構には,機能的蛋白質複合体が大きく関与している。その中でヒストンH2AXは,重要な役割をなすと推定されているが,それを解析するには,H2AXの機能的蛋白質複合体の網羅的解析が必要である。本研究では,ハーバード大学中谷が開発した培養細胞を用いた機能的蛋白質複合体の精製法を進化させ,tagを付与したH2AXのトランスジェニックマウスを作成し,in vivoの臓器での生理的条件下におけるH2AXの機能的蛋白質複合体の精製法の開発とその網羅的MS/MS解析を行う。
1)マウスH2AXのクローニング
RT-PCRによりクローニングしたマウスH2AXを発現vectorに導入し,その際,N末端およびC末端にFlagおよびHAのepitope tagを付与した。次にH2AXの発現vectorを293培養細胞に遺伝子導入し,western blotting法により実際にH2AXがタンパクとして発現していることを確認した。
1)H2AX複合体精製過程の条件検討
HeLa培養細胞にクローニングしたマウスH2AXをレトロウイルスを用いて導入し,安定形質株を樹立した。この細胞株より核分画を調整し,核抽出分画およびクロマチン分画においてH2AXの発現を検討した。その結果,クロマチン分画においてH2AXの発現が優位であることが明らかとなった。クロマチン分画からの精製に際し,マイクロコッカルヌクレアーゼによってクロマチン分画を処理する必要がり,その至適条件を検討後,精製を行った。その結果,マウスH2AXを複合体として精製することに成功した。またこれらの精製を行ったことにより,付与したタグを用いてのアフィニテイークロマトグラフィー精製の免疫沈降が可能であることも明らかとなった。これらの条件をtransgenic mouseの臓器からの複合体精製の指標とする。
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