酸化ストレス解析のための特異的モノクローナル抗体作製法の開発

2003 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 15651100
• 研究機関: 北海道大学
• 研究代表者: 坂口 和靖 北海道大学, 大学院・理学研究科, 教授 (00315053)
• 研究分担者: 下東 康幸 九州大学, 大学院・理学研究院, 教授 (00211293)
• キーワード: 抗体 / 酸化ストレス / メチオニンスルホキシド / 活性酸素 / ペプチド / ビオチン-アビジン / 翻訳後修飾

研究概要

タンパク質の機能制御・安定性変化に関わる修飾の検出・解析には修飾部位を特異的に認識する抗体の使用が必須である。しかしながら、酸化によるタンパク質の修飾部位のみを特異的に認識する抗体は実用化されていないのが現状であり、酸化ストレスによる修飾を特異的に認識する抗体の開発が切望されている。本研究の目的は、「タンパク質の酸化ストレスによるタンパク質修飾を特異的に認識するモノクローナル抗体を開発する」ことである。
本年度は、まず抗原用メチオニンスルホキシド含有ペプチド2種とスクリーニング用ペプチド2種をFmoc固相法により合成しHPLCにより精製した。2種抗原用ペプチドをマレイミド化したキャリアタンパク質KLHと結合させ、これをBALB/cマウスに免疫した。摘出した大腿部リンパ節から得られたB細胞をミエローマと融合しハイブリドーマを得た。現在、特異的抗体を産生するクローンを3種のペプチドを用いたELISA法によりスクリーニングした。その結果、ペプチド配列を認識するハイブリドーマは得られたが、これらのハイブリドーマの酸化メチオニン体に対する特異性は非常に低く満足のいくものではなかった。
また、平行して新規モノクローナル抗体スクリーニング法に使用する化合物BIRLの合成を実施した。化合物BIRLは、まずビオチン化リンカーの大量合成法を確立した後、これをFmoc-Lys(Boc)-OHと縮合した。このLys誘導体のα-アミノ基をヨード酢酸化し、その後側鎖アミノ基に蛍光基ローダミンを付加することにより、化合物BLIRを合成した。

研究成果

• [文献書誌] Sakaguchi, K.: "Phosphorylation Site-Specific Monoclonal Antibody Recognizing Ser(P)-Gin Sequence"Peptide Science. 2002. 439-442 (2003)
• [文献書誌] Fukahori H.: "Specific Affinity Labeling of Delta Opioid Receptors via Thiol-Disulfide Exchange Reaction"Peptide Science. 2002. 257-260 (2003)
• [文献書誌] Honda, K.et al.: "Localization Profiles of the Precursor Protein of Circadian Rhythm Pacemaker Hormone PDF in Gryllus Brain"Peptide Science. 2002. 433-436 (2003)
• [文献書誌] Higashimoto, Y.: "Destabilization and Oligomer Formation of p53 Tetramer Mutant Associated with Human Lung Carcinoma"Peptide Science. in press. (2004)
• [文献書誌] Honda K.: "Specific Affinity Labeling of Cys60 in the δ Opioid Receptor by Npys-containing Dynorphin A Anolog"Peptide Science. in press. (2004)
• [文献書誌] Sakaguchi, K.: "Hetero-Oligomer Formation of Peptides Derived from Tetramerization Domain in Tumor Suppressor Protein p53"Peptide Science. in press. (2004)