|
本年度は、ハイブリッド染色体キャリヤーを使ってオボアルブミンプロモーターによって目的遺伝子を発現させるために、オボアルブミン遺伝子座へ相同組換えするためのベクターを作製した。オボアルブミンプロモーター領域とオボアルブミン構成遺伝子領域に挟んだ形でまず薬剤耐性遺伝子の発現カセットを組み込んだ後、薬剤耐性遺伝子発現カセットの上流にオボアルブミンプロモーターの制御によって発現するように目的遺伝子を導入したプラスミドベクターを作製した。モデル目的遺伝子としては、ヒト成長ホルモン遺伝子を用いた。現在、作製したベクターをDT-40細胞にエレクトロポレーション法により遺伝子導入し、薬剤による選択で遺伝子導入細胞をスクリーニングしているところである。これと同時に、遺伝子導入したDT-40細胞のコルセミド/サイトカラシンB処理によるミクロセル化誘導のための条件(濃度・誘導時間)検討を行っており、これまでに報告がある条件においてDT-40細胞のミクロセル化が行えることがわかった。今後、密度勾配遠心によって目的染色体を含んだミクロセルの回収が行えるかを検討する。また、ハイブリッド染色体キャリヤーを誘導するためには、コルセミド/サイトカラシンB処理によるDT-40細胞のミクロセル誘導の前に、VSV-G発現ベクターの導入によってDT-40細胞膜上にVSV-Gを一過的に高発現させる必要がある。そのためにVSV-G遺伝子導入条件やミクロセル化のタイミングなどの条件を検討している。この実験では、エレクトロポレーション法では高効率の遺伝子導入が困難であったためリポフェクション法によるDT-40細胞への遺伝子導入を行っているが、現在まで使用したリポフェクション試薬では遺伝子導入効率があまり上がらなかったため、引き続き高効率にDT-40細胞へ遺伝子導入できるリポフェクション試薬のスクリーニングを行っている。
|
