| 研究概要 |
本研究の目的は,In-Cell NMRの手法を用いて,生細胞中の蛋白質間相互作用を直接観測するシステムを確立するというものである.
平成16年度は平成15年度までの結果を基にして以下のポイントについて開発研究を行った.
1.^<13>C/^<15>N二重標識を用いたIn-Cell NMRシグナルの帰属法の検討
細胞の内と外では蛋白質の存在のしかたが異なるため,同一蛋白質であっても,細胞内のものと単離・精製したものではNMRシグナルが異なる可能性が示唆されている.細胞内蛋白質の動態を解析するためには,In-Cell NMRを用いてシグナルの位置特異的帰属を行っていく必要があるが,一方でIn-Cell NMR測定では,細胞中の粘性などの影響でシグナルの線幅が著しく増大するため,解析が困難になることが予想された.今回は大腸菌のCalmodulin (14kDa)大量発現系を用い,^<13>C/^<15>Nユニフォーム標識したIn-Cell NMR試料を調製して,三重共鳴In-Cell NMRを測定することを試みた.その結果,In-Cell NMR条件であっても三重共鳴NMRの測定が可能であり,位置特異的帰属が可能であることが証明された.
2.In-Cell NMRを用いた蛋白質間相互作用の解析の試み
In-Cell NMR法を発展させることで,生細胞内における蛋白質間相互作用を従来法より高分解能で観測できる手法となる可能性がある.高感度2種の蛋白質の大腸菌内共発現系を構築し,In-Cell NMRを用いることで細胞内での蛋白質間相互作用の解析を試みた.
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