|
ネオセントロメアを獲得した細胞株の実験操作下での人為的な取得を可能にするため、染色体セントロメア領域の破壊を条件的に誘導できる分裂酵母モデル系の構築を推進しました。まず、ORF中にloxP配列を含みながらG418薬剤耐性機能を発揮する分裂酵母マーカー遺伝子の作成に成功しました。目指すモデル酵母には、G418耐性マーカー遺伝子が第一染色体セントロメア領域の両端に2つに分断された状態で挿入され、両分断部位に部位特異的組換え酵素Creの標的DNA配列loxPを配することを計画します。こり場合、部位特異的組換えによってセントロメア領域が染色体から切除された細胞のみが、マーカー遺伝子の再縫合によって獲得するG418耐性で選択されます。上述のloxP含有G418耐性遺伝子はこの戦略を可能にしました。さらに、染色体から切除された環状DNAの細胞外排除の確認と染色体再挿入の抑止を、切除領域内に含有するura4^+遺伝子に毒性を与える5-FOA薬剤の添加で行うよう設定します。
G418耐性遺伝子についてはさらにloxP挿入部位の検討とプロモーター強度の調整を行い、最終的に分裂酵母内単コピーでの効率よい機能発現に至りました。また同一の系を用いて分裂酵母における誘導Cre-loxPシステムの作動を確認しました。分断マーカー遺伝子が第一染色体セントロメア両端へ挿入された最終アッセイ株の作成を推進すると同時に、ゲノム導入されたG418耐性遺伝子がloxP部位を挟んでura4^+遺伝子で分断された株を作成し、この株を用いてネオセントロメア獲得株のスクリーンでCre誘導後に行う薬剤G418と5-FOAの添加時期の予備的検討を進め、アッセイ手法の最適化を試みています。
|
