AP-PCR-SSCPを用いた病態特異的な遺伝子多型の網羅的探索法の確立と応用

2004 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 15659133
• 研究機関: 浜松医科大学
• 研究代表者: 前川 真人 国立大学法人浜松医科大学, 医学部, 教授 (20190291)
• 研究分担者: 椙村 春彦 国立大学法人浜松医科大学, 医学部, 教授 (00196742) ; 金森 雅夫 びわこ成蹊スポーツ大学, 教授 (90127019) ; 竹下 明裕 国立大学法人浜松医科大学, 医学部, 助教授 (00242769) ; 堀井 俊伸 国立大学法人浜松医科大学, 医学部附属病院, 助手 (80283430)
• キーワード: AP-PCR / SSCP / SNPs / 遺伝子多型 / テイラーメイド医療

研究概要

特定の病態などの表現型に関連している遺伝子多型を直接検出する方法として、SNPから表現型へ進むのではなく、特定の表現型を説明できる遺伝型を探索するという逆のプロセスをたどるための基本的手法として、AP-PCR (arbitrary primed PCR)-SSCP (single strand conformation polymorphism)を利用した。
1)長寿者とそれ以外のDNAを混合したDNAプールを作成する。100歳以上の百寿者1グループ(9人)、90歳3グループ(8本ずつ)、60歳1グループ(10人)から抽出したgenomic DNAをプールした。
2)13種類のプライマーでAP-PCR (arbitrary primed PCR)を施行した.アガロースゲルで増幅産物を確認後、10%PAG、15℃、3.5時間のSSCP泳動を行った.銀染色による可視化で、表現型によって移動度の異なるバンド、濃さが変化しているバンドを切り出し、再PCRの後、TAクローニングを行い、ベクタープライマーで塩基配列を決定した。
3)BLAST検索により得られた塩基配列から該当する遺伝子を同定した。
4)遺伝子特異プライマーを用いて各表現型の個体それぞれをPCR-SSCP法で解析し、表現型と遺伝型との関連性について検証した。また、塩基配列決定によりSNPを同定した。
その結果判明したSNPのうち、高齢者に高頻度に見いだされたSNPを1つ同定した。高齢者の例数も少なかったことから、医学部学生をコントロールとして分析し、SNPの頻度を比較したところ、Homosapiens 3 BAC RP11-61K12 (AC130566)の8768C>G polymorphismが見いだされた.
この方法の考え方は、絨毯爆撃的にSNPを検出してから意味付けするのではなく、まとまったポピュレーションを説明できるSNPを探していこうというものである。方法として用いたAP-PCR-SSCPは、網羅的な遺伝子増幅プラスSSCPによる一本鎖としての分離と定量性である。今後、本法をさらにブラッシュアップして、プロテオミクス解析で用いられている2次元電気泳動と蛍光標識プライマーによる遺伝子増幅を組み合わせると、より詳細な解析が可能と考える.

研究成果

• [雑誌論文] Pilot study of arbitrarily primed PCR-single stranded DNA conformation polymorphism analysis for screening genetic polymorphisms related to specific phenotypes. (2005)
  • 著者名/発表者名: Maekawa M, Taniguchi T, Uramoto T, Higashi H, Horii T, Takeshita A, Sugimura H, Kanamori M
  • 雑誌名: Clin Chim Acta (in press)
• [雑誌論文] 膵癌の腫瘍マーカー (2005)
  • 著者名/発表者名: 前川 真人
  • 雑誌名: 膵臓 19(6)(in press)
• [雑誌論文] 原発不明癌 (2005)
  • 著者名/発表者名: 前川 真人
  • 雑誌名: 日本分子腫瘍マーカー研究会誌 20(in press)
• [雑誌論文] Problem with Detection of an Insertion-Type Mutation in the BCHE Gene in a Patient with Butyrylcholinesterase Deficiency. (2004)
  • 著者名/発表者名: Maekawa M, Taniguchi T, Ishikawa J, Toyoda S, Takahata N
  • 雑誌名: Clin Chem 50 ページ: 2410-2411
• [雑誌論文] Inactivating mutations of the human base excision repair gene NEIL1 in gastric cancer. (2004)
  • 著者名/発表者名: Shinmura K, Tao H, Goto M, Igarashi H, Taniguchi T, Maekawa M
  • 雑誌名: Carcinogenesis 25 ページ: 2311-2317
• [雑誌論文] High lactate dehydrogenase isoenzyme 1 in a patient with malignant germ cell tumor is attributable to aberrant methylation of the LDHA gene. (2004)
  • 著者名/発表者名: Ishikawa J, Taniguchi T, Higashi H, Miura K, Suzuki K, Takeshita A, Maekawa M
  • 雑誌名: Clin Chem 50 ページ: 1826-1828
• [雑誌論文] Methylation of mitochondrial DNA is not a useful marker for cancer detection. (2004)
  • 著者名/発表者名: Maekawa M, Taniguchi T, Higashi H, Sugimura H, Sugano K, Kanno T
  • 雑誌名: Clin Chem 50 ページ: 1480-1481
• [雑誌論文] Three-dimensional microarray compared with PCR-single-strand conformation polymorphism analysis/DNA sequencing for mutation analysis of K-ras codons 12 and 13. (2004)
  • 著者名/発表者名: Maekawa M, Nagaoka T, Taniguchi T, Higashi H, Sugimura H, Sugano K, Yonekawa H, Satoh T, Horii T, Shirai N, Takeshita A, Kanno T
  • 雑誌名: Clin Chem 50 ページ: 1322-1327
• [雑誌論文] Extensive but hemiallelic methylation of the hMLH1 promoter region in early-onset sporadic colon cancers with microsatellite instability. (2004)
  • 著者名/発表者名: Miyakura Y, Sugano K, Akasu T, Yoshida T, Maekawa M, Saitoh S, Sasaki H, Nomizu T, Konishi F
  • 雑誌名: Clin Gastroenterol Hepatol 2 ページ: 147-156
• [雑誌論文] 遺伝子診断 (2003)
  • 著者名/発表者名: 前川 真人
  • 雑誌名: 現代医療 35(7) ページ: 90-96
• [雑誌論文] 遺伝子検査をとりまく環境と現状・将来 (2003)
  • 著者名/発表者名: 前川 真人
  • 雑誌名: 日本臨床検査自動化学会会誌 28(5) ページ: 613-618