表皮幹細胞を用いた角膜の再生に関する研究

2003 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 15659264
• 研究機関: 愛媛大学
• 研究代表者: 橋本 公二 愛媛大学, 医学部, 教授 (00110784)
• 研究分担者: 白方 裕司 愛媛大学, 医学部, 助手 (50226320)
• キーワード: 幹細胞 / side population / ヘキスト33342 / 高速セルソーター / keratinocyte

研究概要

本研究の目的は、皮膚の幹細胞として注目されている表皮細胞のside population細胞(SP細胞)を用いて角膜を再生することである。SP細胞は、幹細胞が色素を排出する特徴を利用し、ヘキスト33342による染色にて細胞染色し、450nmおよび670nmの紫外線照射により、ヘキストブルー陰性・ヘキストレッド陰性の特徴を持つ細胞として分離される細胞である。本年度はマウスならびにヒト表皮からSP細胞を高速セルソーターで分離し、その幹細胞としての性質の一部である増殖能について検討した。新生児マウス皮膚を外科的に採取し、エタノール処理後、PBSにて洗浄し、ディスパーゼ処理を4℃、18時間行った。表皮と真皮を剥離し、表皮部分をトリプシン処理し細胞を分離した。ヘキスト33342を添加し、37℃60分間染色を行った。遠心操作後細胞を3x10E6/mlの濃度で再懸濁し、高速セルソーター(EPICS ALTRA,ベックマン・コールター社)を用いてSP細胞とMain population細胞(MP細胞)に分離し、I型コラーゲンコートプレートに播種した。無血清培養液を適量加え、数日間培養し、コロニー形成能にて増殖を比較した。形成されたコロニーが角化細胞であることをケラチン14の染色にて確認した。マウス表皮SP細胞はN/C比(細胞質に対する核の比率)が高く、比較的小さな細胞であるのに対し、MPは大型で、N/C比の小さい細胞であった。ソーティングされ、大きなコロニーとなった細胞は、表皮角化細胞の基底細胞のマーカーであるケラチン14で染色されたことより、すべての細胞が角化細胞であることが確認できた。SP細胞は培養数日で大きなコロニーを形成したが、MP細胞は小さなコロニーしか形成せず、長期間の培養でも大きなコロニーにはならなかった。細胞数を測定したところ、SP細胞は1平方センチあたり2000個以上に増殖したが、MP細胞は100個以下であった。マウスと同様の手技でヒト皮膚のSP細胞について検討したところ、おおむね1-5%の細胞がSP細胞であった。継代を繰り返した細胞ではSP分画が減少しているのが確認された。

研究成果

• [文献書誌] Yamasaki K, Hanakawa Y, Tokumaru S, Shirakata Y, Sayama K, Hashimoto K: "SOCS1/JAB and SOCS3/CIS3 negatively regulate the STATs signaling pathway in normal human epidermal keratinocytes"The Journal of Investigative Dermatology. 120. 571-580 (2003)
• [文献書誌] Yamasaki K, Toriu N, Hanakawa Y, Shirakata Y, Sayama K, Hashimoto K: "Keratinocyte growth inhibition by high-dose epidermal growth factor is mediated by transforming growth factor β__・ autoinduction : A negative feedback mechanism for keratinocyte growth"The Journal of Investigative Dermatology. 120. 1030-1037 (2003)
• [文献書誌] Shirakata Y, Tokumaru S, Yamasaki K, Sayama K, Hashimoto K: "So-called biological dressing effects of cultured epidermal sheets are mediated by the production of EGF family, TGF-β__・ and VEGF."The Journal of Dermatological Science. 32. 209-215 (2003)
• [文献書誌] Yahata Y, Shirakata Y, Tokumaru S, Yamasaki K, Sayama K, et al.: "Nuclear translocation of phosphorylated STAT3 is essential for VEGF-induced human dermal microvascular endothelial cell migration and tube formation"The Journal of Biological Chemistry. 278. 40026-40031 (2003)
• [文献書誌] Shirakata Y, Tokumaru S, Yamasaki K, Sayama K, Hashimoto K: "So-called biological dressing effects of cultured epidermal sheets are mediated by the production of EGF family, TGF-β__・ and VEGF."The Journal of Dermatological Science. 32. 209-215 (2003)
• [文献書誌] Nanba D, Mammoto A, Hashimoto K, Higashiyama S: "Proteolytic release of the carboxy-terminal fragment of proHB-EGF causes nuclear export of PLZF."The Journal of Cell Biology. 163. 489-502 (2003)