| 研究概要 |
rat opioid受容体とGFPとの融合遺伝子の作成
pGEMT-easy vectorに組み込まれたrat opioid receptor subtypes(μ,δ,κ)の3種のcDNA(京都大学麻酔科福田教授より提供)をホスト遺伝子として用いた。
1)コントロールの作成
提供されたプラズミドを鋳型にして、両端にそれぞれ、KpnI,XbaI siteを付属したプライマーを用いてPCRを行った。得られたPCR fragmentのdirect sequencingを行い、目的の断片が増幅していることを確認した。得られたPCR fragmentとpcDNA3 vectorを制限酵素KpnI/XbaIで消化し、両者をligationした。
2)opioid receptor-GFPの作成
1と同様の作業を、KpnI/NheI siteを使用して(opioid receptorのstop codonを消してKpnI siteを作りそのままGFP cDNAへと連結する)三種のopioid receptorをそれぞれpEGFPN-1 vectorに組み込んだ。
3)opioid receptor-GFPの機能確認
上記cDNAをDEAE dektran methodにてCOS cellにtransient transfectionし、細胞膜を回収した。
今年度中に、3H-bremazocinを用いて受容体結合試験を行い機能確認をする予定である。GFPとの癒合蛋白質が正常に機能すれば、予定通り来年度よりリガンド刺激による細胞膜内及び細胞内局在のリアルタイムでの観察を行う。
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