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交付申請書に記載の研究計画に従い研究を遂行し、以下の知見を得た。
(1)新規時計関連タンパク質群の解析
研究代表者らがこれまでに同定した概日時計蛋白質E4BP4の機能解析を行った。E4BP4を特異的に認識する抗体を作成し、蛋白質レベルにおける挙動を検討した結果、光感受性の時計組織であるニワトリ松果体においてE4BP4蛋白質は、mRNA発現より数時間遅れて日周変動し、光により蛋白質レベルの誘導を受けることが判明した。さらに、E4BP4は時刻依存的にリン酸化されており、それにはカゼインキナーゼIが関与していること、およびリン酸化によって蛋白質分解が促進されることを発見した。これらのことからE4BP4は蛋白質レベルにおいても約一日周期でダイナミックに変化する分子であり、生物時計の中心的役割を担う分子の一つであると考えられた。
(2)個体レベルにおけるメラトニンリズムの生理的意義
研究代表者らはこれまでに、時計蛋白質BMAL1のドミナントネガティブ分子を松果体特異的に発現するトラジスジェニックゼブラフィッシュを作製し、そのメラトニンリズムが消失していることを見いだした。そこで次に、このリズム消失が全身の末梢時計に与える影響を調べるため、心臓における時計遺伝子発現の変動を調べた。その結果、トランスジェニックゼブラフィッシュにおいても時計遺伝子は日周変動していることが判明し、松果体以外の時計は正常に発振していることが示唆された。このことから、ゼブラフィッシュにおいてメラトニンリズムは末梢時計の発振には必須でないと考えられた。また、ゼブラフィッシュ個体レベルにおける行動リズムに与える影響を調べるために、行動リズム測定記録装置を完成させた。
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