研究課題
CaM kinase kinaseは、CaM kinase IやCaM kinase IVをリン酸化して活性化する酵素であり、CaM kiase カスケードの頂点に存在する酵素である。この酵素の、海馬神経細胞における細胞内局在を免疫染色法及び生化学的手法により検討したところ、αアイソフォームは細胞質と核の両方に、β-アイソフォームは細胞に確認された。これらの活性動態を検討すべく、基質の一つであるCaM kinase IのGST(グルタチオン-S-トランスフェラーゼ)融合タンパク質を調製し、さらに不活性型かつCaM結合部位を欠いた変異体タンパク質を、大腸菌にて調製した。試験管内でリン酸化反応を行い、この変異体が確かにリン酸化を受けかつ不活性型であることを確認した。COS7細胞にCaM kinase kinase αおよびβをそれぞれ発現させて、その細胞抽出液中に含まれる活性を、変異体タンパク質を用いて検討した。αアイソフォームは、カルシウム依存性のリン酸化活性を示したが非依存性活性は得られず、一方βアイソフォームはカルシウム依存性及び非依存性いずれの活性も示した。初代培養海馬神経細胞を調製し、グルタミン酸及び塩化カリウムにより刺激を加えた。過去に作製したCaM kinase kinase αおよびβの抗体でそれぞれ免疫沈降し、免疫沈隆物にこより変異体タンパク質をリン酸化させて、反応液をホスホセルロース紙にスポットし、リン酸化活性を測定したが、各グループ間に顕著な差はみられなかった。そこで現在、リン酸化させた変異体タンパク質をSDS-PAGEによって展開させる電気泳動法による検討を試みている。
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