高等植物のみに存在する2種類の新規A型DNAポリメラーゼの機能解析

2003 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 15770031
• 研究機関: 東京理科大学
• 研究代表者: 木村 成介 東京理科大学, 理工学部, 助手 (40339122)
• キーワード: OsPolI-1ike / A型DNAポリメラーゼ / 高等植物 / 葉緑体 / DNA複製 / DNA

研究概要

高等植物にのみに存在する新規のA型DNAポリメラーゼ2種類(PolI-like1とPolI-like2)の機能を解明することを目的とし研究を進めた。本年度においては、2種類の遺伝子のクローニング、発現パターンの解析、抗体の作製、ノックダウン植物の作出などを主な目的とした。
まず、イネおよびアラビドプシスから2種類のA型ポリメラーゼ(OsPolI-like1,OsPolI-like2,AtPolI-like1,AtPolI-like2)をRT-PCR法などにより単離した。
発現パターンを解析したところ2種類とも分裂組織で多く発現していたが、PolI-like1のほうが発現が強く、PolI-like2の発現は弱いものであることなどが分かった。
大腸菌の大量発現系によりAtPolI-like1とAtPolI-like2蛋白質を発現させたところ、PolI-like1を可溶蛋白質として得ることができた。この蛋白質のDNA合成酵素活性を測定したところ、活性を有していることが分かった。現在生化学的解析を進めると同時に特異抗体を作出中である。
PolI-like1とPolI-like2の機能を解析するため、ノックダウン植物の作出を行った。作出にはイネのRNAi用のトランスジェニックベクターであるpANDAを用いた。そこで、PolI-like1とPolI-like2は配列に相同性がある。相同性の低い3'-UTRの部分でRNAiコンストラクトを作製することでそれぞれを独立してノックダウンすることを試み、また、相同性の高い領域を用いることで両因子を同時にノックダウンすることを試みた。現在3系統(PolI-like1のノックダウン、PolI-like2のノックダウン、両因子のノックダウン)の再分化が終了し、育成中である。

研究成果

• [文献書誌] Yamamoto T. et al.: "Characterization of Rad6 from a higher plant, rice (Oryza sativa L.) and its interaction with Sgt1, a subunit of the SCF ubiquitin ligase complex"Biochemical and Biophysical Research Communications. 314. 434-439 (2004)
• [文献書誌] Yamamoto T. et al.: "Degradation of proliferating cell nuclear antigen by 26S Proteasome in the Oryza sativa strain of rice"Planta. 印刷中.
• [文献書誌] Yamaguchi T. et al.: "Expression of flap endonuclease-1 during meiosis in a basidiomycete, Coprinus cinereus"Fungal Genetics and Biology. 印刷中.
• [文献書誌] Kimura et al.: "Functional characterization of two flap endonuclease-1 (FEN-1) homologues in rice"GENE. 314. 63-71 (2003)
• [文献書誌] Furukawa et al.: "OsSEND-1 : a new Rad2 nuclease family member in higher plant"Plant Molecular Biology. 51. 59-70 (2003)
• [文献書誌] Ishibashi et al.: "Rice UV-DDB homologues are most abundant in proliferating tissues"Gene. 308. 79-87 (2003)