研究概要 |
高等植物にのみに存在する新規のA型DNAポリメラーゼ2種類(PolI-like1とPolI-like2)の機能を解明することを目的とし研究を進めた。本年度においては、2種類の遺伝子のクローニング、発現パターンの解析、抗体の作製、ノックダウン植物の作出などを主な目的とした。 まず、イネおよびアラビドプシスから2種類のA型ポリメラーゼ(OsPolI-like1,OsPolI-like2,AtPolI-like1,AtPolI-like2)をRT-PCR法などにより単離した。 発現パターンを解析したところ2種類とも分裂組織で多く発現していたが、PolI-like1のほうが発現が強く、PolI-like2の発現は弱いものであることなどが分かった。 大腸菌の大量発現系によりAtPolI-like1とAtPolI-like2蛋白質を発現させたところ、PolI-like1を可溶蛋白質として得ることができた。この蛋白質のDNA合成酵素活性を測定したところ、活性を有していることが分かった。現在生化学的解析を進めると同時に特異抗体を作出中である。 PolI-like1とPolI-like2の機能を解析するため、ノックダウン植物の作出を行った。作出にはイネのRNAi用のトランスジェニックベクターであるpANDAを用いた。そこで、PolI-like1とPolI-like2は配列に相同性がある。相同性の低い3'-UTRの部分でRNAiコンストラクトを作製することでそれぞれを独立してノックダウンすることを試み、また、相同性の高い領域を用いることで両因子を同時にノックダウンすることを試みた。現在3系統(PolI-like1のノックダウン、PolI-like2のノックダウン、両因子のノックダウン)の再分化が終了し、育成中である。
|