| 研究概要 |
本年度は,BTG/Tobファミリー蛋白質のうちTob及びその複合体パートナー蛋白質であるhCaf1を大腸菌による組換え蛋白質として大量発現し,結晶化に十分な純度まで精製する方法を確立した.具体的には以下のような手順で研究を進めた.
(1)Tob及びhCaf1のcDNAを入手し,大腸菌における発現ベクターへの組込みを行い,組換え蛋白質の発現を確認した.
(2)Tob及びhCaf1組換え蛋白質の大量発現条件を検討した.最初は数百ミリリットルの培養液を用いて培養を進め,最終的には10リットル程度の大量培養が再現性良く行えるような条件を決定した.
(3)大量培養によって得られた組換え蛋白質を収率よく高純度かつ大量に取得できるように精製条件を決定した.またアミノ末端分析及び質量分析により,精製品の化学的な同定を行った.円偏光二色性スペクトルの測定により,TobあるいはhCaf1蛋白質はそれぞれ単独で高次構造を有していることが明らかとなった.また両者を混合すると複合体を形成することをゲルろ過により確認した.今後はこの複合体を用いた結晶化を進める予定である.
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