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私たちは、細胞内アクチン骨格の脱重合・切断因子のコフィリンを不活性化するLIMキナーゼ(LIMK)と活性化するSlingshot(SSH)を発見しその機能解析を進めてきた。コフィリンは、アクチン骨格のダイナミクスを調節する重要な因子の一つであるが、その活性の時間的・空間的な制御機構は未だ不明な点が多く残されている。本研究は、LIMKやSSHの活性調節因子、局在を規定する足場タンパク質を同定し、コフィリンによるアクチン骨格再構築の時間的・空間的な制御機構の解明を目的とする。より生理的な相互作用をする分子を検索するため、新たな同定方法として2段階精製を行うアフィニティータグを付加したLIMKとSSHのプローブを作製し、培養細胞より結合タンパク質を精製する方法を導入した。LIMKのN末端のLIMドメインは、LIMKの活性や局在を調節する機能を持つことが明らかとなったため、最初にLIMドメインにprotein Aの一部とカルモジュリン結合ペプチドの配列をタンデムに並べた精製用タグ(TAP-tag)を付加した発現プラスミドを作製した。これをヒト培養細胞に発現させ、細胞内で結合したタンパク質のアフィニティー精製を行った。IgG固相化担体とカルモジュリン固相化担体を用いて精製を行った結果、LIMドメインに特異的に結合していると考えられるタンパク質が検出された。これまで、1段階の精製では非特異的吸着によるバックグラウンドが高く微量の結合タンパク質の検出は困難であったが、この方法は非常にバックグラウンドが低く有効であることが確かめられた。今後、検出されたタンパク質を質量分析機により同定するためスケールアップを行う予定である。また、SSHも同様の解析を行い、細胞内で結合し活性を調節する足場タンパク質等の同定を進める予定である。
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