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本研究は、これまでの研究成果の蓄積をふまえて好アルカリ性Bacillus pseudofirmus OF4株由来のMrpシステムについて構造面と機能面から研究に取り組んだ。構造面からは、これまで精製報告のないMrpシステムの精製を行うため、T7-tagやHis-tagとの融合タンパク質を用いて精製する方法を試みた。また、分光学的なアプローチで酸化還元中心に関与するサブユニットの知見を得るため、7つのMrpサブユニットを別々に発現・精製することを試みた。機能面としてMrpシステムが一次能動輸送として働くならば、おそらく未同定基質の酸化還元エネルギーを利用していると仮定し、未同定基質の探索を試みた。
2003年度の成果として以下のような知見を得た。
1.MrpシステムをT7-tagやHis_6-tagを付加するため高発現ベクターpET21bにクローニングし、その融合発現複合体のNa^+/H^+アンチポーター活性が野生株のものと同程度であることを確認した。
2.1で作成したプラスミドを用いて大腸菌C41株でMrpシステムの発現・精製を試みた。現在までのところ、His_6-tagでのアフィニティカラム精製での収量が悪いことから、His10-tag、S-tagに変更して実験を行う予定で、プラスミドの構築を行っている。
3.各サブユニットをそれぞれ単独でpET21bにクローニングした。
4.3で作成したプラスミドを用いて大腸菌C41株で各遺伝子産物を発現させ、精製とウエスタンブロットを現在、行っている。これに関しては、平成16年度の早い時期にすべてのサブユニットについて終了したいと考えている。
5.Mrpサブユニットの未同定基質の探索に関しては、現在までに有力な候補を見いだせないでいる。今後、さらなる検討を行う予定でいる。
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