| 研究概要 |
本研究では、ゲノム解析から見出された推定のテルペン環化酵素の機能解析を行い、新規環状骨格を形成する環化酵素の発見につなげることを目的としている。
本年度において、結核菌Mycobacterium tuberculosis由来の推定環化酵素のクローニング・大腸菌における発現・酵素活性検定を進めた。基質はゲラニルゲラニル2リン酸であることが判明した。さらに、生成物の単離を行い、MSとNMRにて構造を決定した。その結果、今までに見出されていないハリマン骨格のジテルペンであることが解った。
この結果に基づき、他のミコバクテリア属にも新規テルペンが存在するのではないかと予想し、Mycobacterium smegmatisの炭化水素成分のGC-MS分析を行ってみた。その結果、結核菌よりも炭素数が大きく環状骨格を持つと考えられるテルペンが検出された。現在、大量培養を行い、単離精製を行っている。
また、以前から研究を行ってきているトリテルペン環化酵素の触媒機構の解明も進めた。今回、脱プロトン化の詳細な触媒機構を解明するため、推定の脱プロトン化部位に位置する10個のアミノ酸残基を標的にした変異型酵素を作成し、生成物の分布や速度論定数を解析した。Q262とP263が、ホパノールやhop-21(22)-eneの様な副生成物の形成を抑えるために有効に働くことが判明した。また、水素結合ネットワークの構成アミノ酸残基(T41,E45,E93,R127およびW133)は、脱プロトン化の反応速度を促進するために重要であることが解った。さらに、Y267,F434およびF437の芳香族側鎖は、おそらく酵素の表面から反応キャビティーへ基質を導く機能をもっていると推定できた。
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